潘峰，程艷香，范里，陳安民，郭風(fēng)勁，李章華，陶鳳華，陶海鷹，孫虹

他克莫司抑制脂質(zhì)過氧化對大鼠脊髓的保護(hù)效應(yīng)觀察

潘峰，程艷香，范里，陳安民，郭風(fēng)勁，李章華，陶鳳華，陶海鷹，孫虹

目的探討大鼠脊髓損傷后早期應(yīng)用他克莫司對脊髓的保護(hù)效應(yīng)。方法健康成年雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為他克莫司組(n=20)和損傷組(n=20)。采用Allen′s法建立大鼠脊髓損傷模型，他克莫司組在脊髓損傷后5min一次性經(jīng)尾靜脈注射他克莫司0.3mg/kg，損傷組以相同方法給予等量生理鹽水。傷后3、7、14、21d應(yīng)用BBB評分法進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能評價(jià)，并分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量變化，免疫組織化學(xué)染色檢測脊髓組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)。結(jié)果與損傷組比較，他克莫司組各時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評分明顯改善(P＜0.05或P＜0.01)，血漿MDA含量降低、SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。損傷組和他克莫司組iNOS蛋白表達(dá)均于傷后3d升高，7d達(dá)峰值，且他克莫司組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞率均明顯低于損傷組(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論他克莫司可減少大鼠脊髓損傷后iNOS的表達(dá)和自由基生成，從而抑制脂質(zhì)過氧化損傷，改善神經(jīng)功能。

脊髓損傷；自由基；脂質(zhì)過氧化作用；他克莫司

創(chuàng)傷性脊髓損傷的病理生理改變是在原發(fā)性機(jī)械創(chuàng)傷和繼發(fā)性損傷共同作用下產(chǎn)生的，就治療時(shí)序而言，臨床干預(yù)僅限于繼發(fā)性損傷過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮(nitric oxide，NO)等自由基大量生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷與繼發(fā)性脊髓損害密切相關(guān)，通過藥物干預(yù)自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)治療脊髓損傷已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[1]。我們的前期研究證實(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑他克莫司對脊髓損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未完全闡明[2]。本研究旨在探討他克莫司對大鼠脊髓損傷后血漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)的影響，以明確他克莫司能否通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)揮脊髓保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 成年雄性健康Wistar大鼠40只，體重200～260g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為2組：①他克莫司組(n=20)，脊髓損傷后5min一次性經(jīng)尾靜脈注射他克莫司0.3mg/kg；②損傷組(n=20)，脊髓損傷后5min一次性經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2 脊髓損傷模型的制備 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，損傷組和他克莫司組采用Allen′s法建立脊髓損傷模型：切除T9－T10椎板，用質(zhì)量為10g的金屬棒從4.0cm高處自由落下撞擊硬膜囊，損傷直徑約3.0mm，金屬棒下落后大鼠迅速出現(xiàn)搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動(dòng)后雙后肢呈弛緩性癱瘓，表明撞擊成功，止血后縫合切口。術(shù)后小心飼養(yǎng)，每8h人工按壓排尿。

1.3 脊髓功能評分 采用脊髓運(yùn)動(dòng)功能BBB(Basso Beattie and Bresnahan)評分法[3]對各組大鼠脊髓損傷后的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評定，包括后肢髖、膝、踝關(guān)節(jié)主動(dòng)活動(dòng)范圍，后足負(fù)重狀況，前后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性，后爪抬起和觸地時(shí)腳趾的動(dòng)作，尾部運(yùn)動(dòng)，軀干穩(wěn)定性等項(xiàng)目，滿分為21分。損傷組和他克莫司組分別在術(shù)后3、7、14、21d進(jìn)行評分，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只。兩名評分者為非本實(shí)驗(yàn)組人員且熟知評分標(biāo)準(zhǔn)，每人分別對一側(cè)后肢獨(dú)立進(jìn)行評估，共測定3次，取平均值，若兩人所得分值不等，則再取平均值。

1.4 血漿SOD活性及MDA含量測定 損傷組和他克莫司組各5只大鼠在上述各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行脊髓功能評分結(jié)束后經(jīng)腹腔內(nèi)麻醉后開胸，經(jīng)右心室取血3ml，在預(yù)冷肝素抗凝試管中混勻，4℃下2000r/ min離心10min，取上清液，–80℃保存。SOD和MDA測定試劑盒均購自南京建成生物研究所。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，測定波長550nm，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，測定波長532nm，具體操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。721型可見光分光光度計(jì)為上海醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品。

1.5 脊髓標(biāo)本取材及切片制備 每組5只大鼠在上述各時(shí)間點(diǎn)取血完畢后，立即切取以傷段為中心長約8mm的脊髓組織，橫斷為兩等份，任取一半組織投入4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。

1.6 免疫組化檢測大鼠脊髓iNOS蛋白表達(dá) 兔抗大鼠iNOS多克隆抗體及SABC試劑盒均購自武漢Boster生物工程公司。從各組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)每只大鼠脊髓組織連續(xù)切片中隨機(jī)抽取3張，脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清室溫封閉20min，加入兔抗大鼠一抗(1:80稀釋)后4℃過夜，然后滴加生物素化羊抗兔二抗37℃孵育20min，滴加試劑SABC 37℃孵育20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，依次脫水、透明，封固后在光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。計(jì)算每張切片的陽性細(xì)胞百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓功能評分 損傷組和他克莫司組大鼠傷后短時(shí)間內(nèi)雙后肢功能完全喪失，動(dòng)物俯臥位行走，尿潴留。損傷組傷后3d時(shí)BBB評分為3.41±1.33；他克莫司組傷后3d時(shí)脊髓功能即有所恢復(fù)，BBB評分為5.38±1.29，顯著高于損傷組。損傷組和他克莫司組傷后7d大鼠后肢肌力逐漸開始恢復(fù)，14d和21d時(shí)兩組脊髓功能明顯恢復(fù)，但組間差距也增加，至傷后21d兩組評分分別為13.69±1.55和18.44±1.92(表1)。他克莫司組傷后各時(shí)間點(diǎn)BBB評分均顯著高于損傷組(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 血漿SOD活性及MDA含量檢測結(jié)果 傷后3d損傷組與他克莫司組SOD活性均降至最低點(diǎn)，損傷組下降更為明顯，傷后7～14d逐漸回升，損傷組與他克莫司組間差距增大，至傷后21d，損傷組血漿SOD活性仍未恢復(fù)至正常水平，而他克莫司組SOD活性已遠(yuǎn)高于損傷組(表1)，各時(shí)間點(diǎn)兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。損傷組血漿MDA水平在傷后3d即有明顯升高，至傷后7d達(dá)峰值，然后逐步回落；他克莫司組傷后3d血漿MDA含量升高，但低于損傷組，3～7d維持在相對穩(wěn)定的水平，然后回落(表1)，兩組在傷后3、7、14d時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 脊髓組織iNOS蛋白表達(dá)水平 iNOS陽性表達(dá)主要分布在脊髓前角和中央管周圍的大多角形細(xì)胞以及后角的小圓細(xì)胞中，根據(jù)其形態(tài)和分布規(guī)律推測主要為神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞，另有部分血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可見iNOS陽性表達(dá)。損傷組傷后3d即可見較多細(xì)胞表達(dá)iNOS，至7d達(dá)峰值，陽性細(xì)胞百分比為61.41%±5.36%，之后緩慢下降，至21d仍可觀察到明顯表達(dá)。他克莫司組iNOS表達(dá)水平低于損傷組，高峰亦發(fā)生在傷后7d，陽性細(xì)胞百分比為49.03%±5.91%，然后逐步回落(表1，圖1)。兩組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 大鼠傷后不同時(shí)間點(diǎn)BBB評分、血漿SOD活性和MDA含量、脊髓組織iNOS表達(dá)情況(±s, n=5)Tab. 1 Profiles of BBB score, SOD activity and MDA level in plasma, expression of iNOS in spinal cord-injured rats at different time points (±s, n=5)

表1 大鼠傷后不同時(shí)間點(diǎn)BBB評分、血漿SOD活性和MDA含量、脊髓組織iNOS表達(dá)情況(±s, n=5)Tab. 1 Profiles of BBB score, SOD activity and MDA level in plasma, expression of iNOS in spinal cord-injured rats at different time points (±s, n=5)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with injury group; (3)P＜0.05, (4)P＜0.01 compared with 3d; (5)P＜0.05, (6)P＜0.01 compared with 7d; (7) P＜0.01 compared with 14d

14 21 BBB score Injury group 3.41±1.33 7.64±0.88(4) 12.49±1.71(4)(6) 13.69±1.55(4)(6)Tacrolimus group 5.38±1.29(1) 10.05±1.42(1)(4) 17.27±1.85(2)(4)(6) 18.44±1.92(2)(4)(6)SOD activity (U/ml) Injury group 36.65±12.11 82.57±11.01(4) 112.38±14.10(4)(6) 127.43±10.85(4)(6)Tacrolimus group 54.85±8.26(1) 143.78±17.09(2)(4) 175.62±18.18(2)(4)(6) 186.46±19.48(2)(4)(6)MDA level (nmol/ml) Injury group 7.87±0.62 8.51±0.76 6.13±0.56(4)(6) 3.89±0.60(4)(6)(7)Tacrolimus group 6.55±0.40(2) 6.42±1.11(2) 5.30±0.44(1)(4)(5) 3.17±0.21(4)(6)(7)Expression of iNOS protein (%) Injury group 52.70±6.33 61.41±5.36(3) 45.47±6.24(6) 30.13±5.16(4)(6)(7)Tacrolimus group 39.74±4.87(2) 49.03±5.91(2)(3) 31.48±5.74(2)(3)(6) 21.09±4.22(1)(4)(6)(7)Item Time after operation (d) 3 7

圖1 兩組大鼠傷后3d脊髓組織中iNOS的表達(dá)情況(免疫組化染色 ×200)Fig. 1 iNOS expression in myeloid tissue 3 days after rat injury (Immunohistochemistry staining ×200)

3 討 論

哺乳動(dòng)物體內(nèi)有3種NOS亞型。Ⅰ型和Ⅲ型在體內(nèi)恒定表達(dá)，稱為固有型NOS(constitutive NOS，cNOS)，其活性依賴于Ca2+濃度。Ⅱ型即iNOS，在各種刺激下誘導(dǎo)生成[4]，其活性不依賴于Ca2+濃度，在正常生理狀態(tài)下含量極低[5]，但脊髓損傷后，隨著中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤及炎癥因子的產(chǎn)生，iNOS表達(dá)逐漸增加。由于iNOS不依賴于Ca2+即可與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合，通過級聯(lián)放大作用產(chǎn)生大量NO，遠(yuǎn)超過cNOS作用下產(chǎn)生的NO量。NO與氧及活性氧中間產(chǎn)物、巰基化合物相互作用產(chǎn)生其他生物活性分子，如ONOO－、NO＋及，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，引起嚴(yán)重的細(xì)胞氧化損傷[1]。同時(shí)NO本身也可通過多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。Xu等[7]應(yīng)用免疫組化和Western blotting方法檢測脊髓損傷后iNOS及蛋白氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物亞硝基酪氨酸的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，兩者均于損傷后1d增加，7d達(dá)峰值，且iNOS表達(dá)水平與其活性水平在時(shí)間變化上相一致。Moon等[8]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸根提取物通過抑制iNOS的表達(dá)，可減輕脊髓損傷后氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷后iNOS表達(dá)明顯增加，于傷后7d達(dá)峰值，至21d仍維持在較高水平，而傷后早期給予他克莫司可顯著降低iNOS表達(dá)，提示iNOS表達(dá)上調(diào)可能在脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，iNOS表達(dá)受抑可能參與了他克莫司的神經(jīng)保護(hù)作用。

脊髓損傷后組織缺血、缺氧，iNOS表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生并釋放大量包括活性NO族在內(nèi)的自由基。自由基含有不配對電子，性質(zhì)極不穩(wěn)定，極易攻擊生物膜上多價(jià)不飽和脂肪酸的丙烯雙鏈，形成連鎖式的鐵離子依賴性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞膜結(jié)構(gòu)的通透性和完整性，其中NO與超氧負(fù)離子相互作用產(chǎn)生高反應(yīng)活性的－OH和ONOO－，引發(fā)更為嚴(yán)重的細(xì)胞氧化損傷[1]。MDA為脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物，可反映體內(nèi)自由基的生成和脂質(zhì)過氧化水平，SOD為自由基的清除劑，通過催化歧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷，兩者是目前公認(rèn)的反映自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的指標(biāo)[9]。Kanter等[10]研究證實(shí)脊髓損傷后MDA含量增高，SOD活性下降，二者呈負(fù)相關(guān)，與本研究損傷組的測定結(jié)果一致，提示脊髓損傷后自由基生成增加、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)。Fan等[11]研究發(fā)現(xiàn)提高SOD活性對脊髓損傷有明顯的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)他克莫司組SOD活性高于損傷組、脊髓功能BBB評分優(yōu)于損傷組亦為其提供了佐證，說明脊髓損傷早期應(yīng)用他克莫司抑制和清除自由基可促進(jìn)后期功能恢復(fù)。此外，本研究選擇SOD和MDA作為衡量脊髓損傷后自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的指標(biāo)，而未直接檢測血漿或脊髓組織中NO自由基的生成水平，這主要是基于如下考慮：①NO的半衰期極短，生成后即與活性氧族相互作用生成其他活性分子[12]，因而難以準(zhǔn)確測量；②NO引起的氧化損傷并不僅僅限于其本身，前已述及，NO與氧及活性氧中間產(chǎn)物等相互作用產(chǎn)生的ONOO－、NO＋等可導(dǎo)致更為嚴(yán)重的細(xì)胞氧化損傷，因此NO及其衍生物共同參與了脊髓繼發(fā)性損傷過程，僅對NO水平進(jìn)行檢測有失偏頗，而SOD和MDA含量測定則能全面反映脊髓損傷后自由基的生成水平及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷的程度。

本課題組前期研究證實(shí)他克莫司可減少脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。Yousuf等[13]在大鼠脊髓背側(cè)柱缺氧損傷模型中發(fā)現(xiàn)，他克莫司可通過抗氧化作用保護(hù)線粒體功能，減少梗死面積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，他克莫司組脊髓損傷后iNOS表達(dá)和血漿MDA含量明顯低于損傷組，而SOD活性顯著高于損傷組，表明他克莫司可抑制傷后iNOS表達(dá)，減少NO等自由基的生成，提高SOD活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而進(jìn)一步的脊髓功能評分顯示，傷后各時(shí)間點(diǎn)他克莫司組BBB評分均顯著高于損傷組，表明脊髓損傷后早期應(yīng)用他克莫司可有效抑制自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕其對神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后SOD活性最低點(diǎn)與MDA含量最高點(diǎn)之間存在一個(gè)時(shí)間差，提示他克莫司提高SOD活性只能減輕而不能完全阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，因此，還需通過其他途徑從多個(gè)方面抑制自由基產(chǎn)生及其導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷。

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Neuroprotective effect of tacrolimus on injured spinal cord of rats via attenuating lipid peroxidation

PAN Feng1, CHENG Yan-xiang2, FAN Li1, CHEN An-min3, GUO Feng-jing3, LI Zhang-hua1, TAO Feng-hua1, TAO Haiying1, SUN Hong1
1Department of Spine Surgery,2Department of Gynaecology and Obstetrics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
3Department of Orthopaedics, Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
This work was supported by the Provincial Natural Science Foundation of Hubei (2012FFB04406)

ObjectiveTo study the neuroprotective effect of tacrolimus on early injury of rats′ spinal cord and its underlying mechanism.MethodsForty-five healthy male Wistar rats were randomly divided into injury group (n=20) and tacrolimus group (n=20). The rats in the two groups were subjected to contusion of spinal cord injury (SCI) at the T10level with weight-drop impact (Allen′s method). Animals in tacrolimus group were administered with tacrolimus (0.3mg/kg) 5min intravenously after SCI, while those in the injury group

equal volume of normal saline. BBB scales were used to assess the neurological function of hind limbs 3, 7, 14, and 21 days after SCI. Superoxide dismutase (SOD) activity and malonaldehyde (MDA) level in the plasma were measured by xanthine oxidase and thiobarbituric acid (TBA) method respectively. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in spinal cord was detected by immunohistochemistry staining.ResultsThe BBB score was significantly higher, the plasma MDA level was obviously lower and SOD activity was remarkably higher in tacrolimus group than those in injury group (P＜0.05, P＜0.01). The expression of iNOS protein in spinal cord began to increase on the 3rd day after SCI and reached the peak at the 7th day in both injury and tacrolimus group, and the iNOS positive cell rate was significantly lower in tacrolimus group than in injury group at each time point (P＜0.05, P＜0.01).ConclusionTacrolimus may inhibit the expression of iNOS and decrease the generation of free oxygen radicals after SCI, thus attenuate lipid peroxidation and improve neurological function.

spinal cord injuries; free radicals; lipid peroxidation; tacrolimus

R651.21

A

0577-7402(2013)04-0279-04

2012-10-15；

2013-02-21)

(責(zé)任編輯：胡全兵)

湖北省自然科學(xué)基金(2012FFB04406)

潘峰，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。主要從事脊柱脊髓損傷的基礎(chǔ)與臨床研究

430060 武漢 武漢大學(xué)人民醫(yī)院脊柱外科/骨一科(潘峰、范里、李章華、陶鳳華、陶海鷹、孫虹)，婦產(chǎn)科(程艷香)；430030 武漢 華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科(陳安民、郭風(fēng)勁)