陳旺盛，傅仲學，黃春，文坤明，錢江，馮繼紅，李雷

食管癌(esophageal carcinoma)是常見的消化道惡性腫瘤，預后差，病死率高[1-2]。我國是食管癌高發(fā)國家，研究食管癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。Cripto-1又稱畸胎瘤衍生因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)，是表皮生長因子-CFC家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)Cripto-1可通過促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成以及誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)而在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3-8]。本研究通過檢測Cripto-1、上皮標記物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、間葉標記物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)在食管癌中的表達，探討Cripto-1在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其與EMT的關系。

1 材料與方法

1.1 標本 收集2011年4－9月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸心外科行手術治療的41例食管癌患者的癌灶中心組織、癌旁(距癌灶邊緣5cm以內(nèi))組織及正常食管黏膜(手術切緣經(jīng)病理證實無腫瘤細胞)組織標本。41例患者中，男28例，女13例，年齡42～75歲，平均54歲，所有患者術前均未進行新輔助放/化療及生物治療，均經(jīng)病理檢查明確診斷。標本離體后迅速采集并分為兩份，一份置于液氮中，24h后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存，另一份用10%中性甲醛固定備用。

1.2 主要試劑 兔抗人Cripto-1、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白單抗購自美國Epitomics公司；內(nèi)參GAPDH一抗購自北京四正柏生物科技有限公司；山羊抗兔二抗、凱基全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司；Western blotting配膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、PVDF膜購自江蘇碧云天公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、中性樹膠、蘇木素染液購自北京康為世紀公司；磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鈉抗原修復液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Trizol、RTPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq酶、DNA Marker購自TaKaRa(大連寶生物)公司。

1.3 RT-PCR檢測Cripto-1 mRNA的表達 按照Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應條件：94℃3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，40個循環(huán)；72℃ 4min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio-Rad凝膠成像儀成像，Quantity-One軟件對條帶吸光度值進行半定量分析，以目的條帶吸光度值/內(nèi)參條帶吸光度值的比值作為目的基因的相對表達量。引物由北京華大基因設計并合成，相關引物序列如下：Cripto-1上游引物5'-CACGATGTGCGCAAAGAGA-3'，下游引物5'-TGACCGTGCCAGCATTTACA-3'，擴增長度89bp；GAPDH上游引物5'-AAGGTGAAGGTCGGAAC-3'，下游引物5'-GGGGTCATTGATGGCAACAAT-3'，擴增長度102bp。

1.4 Western blotting檢測Cripto-1蛋白表達 提取組織總蛋白，BCA法定量。上樣量40μg，采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，采用濕法轉(zhuǎn)膜(1kD/min)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1h后加入一抗，抗體的稀釋比例Cripto-1為1∶2000，GAPDH為1∶5000，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，TBST洗膜后ECL發(fā)光。用Quantity-One軟件對條帶的吸光度值進行半定量分析，以目的蛋白條帶的吸光度值/內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的吸光度值的比值表示目的蛋白的相對量。

1.5 免疫組化檢測Cripto-1、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達 所有標本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復，內(nèi)源性過氧化物酶37℃封閉20min；加一抗(抗體稀釋比例Cripto-1為1∶200，N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白為1∶250)，4℃孵育過夜；加二抗37℃孵育30min；加入辣根過氧化物酶(HRP)37℃孵育20min；DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下檢測并拍照。染色結(jié)果根據(jù)陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數(shù)進行分級[9]。陽性細胞百分數(shù)＜5%為0分，5%~25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；細胞染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性強度為兩種計分乘積：0～2分為陰性(－)、3～5分為弱陽性(+)、6～8分為陽性()、9～12分為強陽性()。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師分別進行，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗，相關性分析采用Spearman分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

圖1 Cripto-1 mRNA相對表達水平檢測Fig.1 Expression of Cripto-1 mRNA detected by RT-PCR1. Esophageal carcinoma; 2. Paraneoplastic tissue; 3. Normal esophageal tissue

2.1 Cripto-1 mRNA表達檢測結(jié)果 Cripto-1 mRNA在食管癌組織中的表達(0.35±0.08)明顯高于癌旁組織(0.22±0.04)及正常食管黏膜組織(0.13±0.03，P＜0.05)，而癌旁組織與正常食管黏膜組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1)。

2.2 Cripto-1蛋白表達檢測結(jié)果 Cripto-1蛋白在食管癌組織中的表達(0.62±0.06)明顯高于癌旁組織(0.45±0.07)及正常食管黏膜組織(0.33±0.05，P＜0.05)，而癌旁組織與正常食管黏膜組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

圖2 Cripto-1蛋白表達水平檢測Fig.2 Expression of Cripto-1 protein detected by Western blotting 1. Esophageal carcinoma; 2. Paraneoplastic tissue; 3. Normal esophageal tissue

2.3 Cripto-1、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的免疫組化檢測結(jié)果 Cripto-1、N-鈣黏蛋白陽性著色位于細胞膜和細胞質(zhì)，E-鈣黏蛋白陽性著色位于細胞膜，波形蛋白陽性著色位于細胞質(zhì)(圖3)。Cripto-1、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、E-鈣黏蛋白在食管癌組織中的陽性表達率分別為53.7%、51.2%、61.0%、36.6%。

2.4 Critpo-1在食管癌中的表達與臨床病理資料的關系 Cripto-1在不同性別、年齡、侵襲范圍及臨床分期中的表達情況見表1。統(tǒng)計學分析顯示，Cripto-1在食管癌中的表達與患者的年齡、性別和浸潤范圍無顯著相關性(P＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(P＜0.05，表1)。

圖3 Cripto-1、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、E-鈣黏蛋白在食管癌組織中的表達(SP ×400)Fig.3 Expression of Cripto-1, N-cadherin, vimentin, E-cadherin protein in esophageal carcinoma tissue (SP ×400)A. Cripto-1; B. N-cadherin; C. Vimentin; D. E-cadherin

表1 食管癌組織中Cripto-1蛋白表達與臨床病理資料的關系(n=41)Tab.1 Relationship between the expression of Cripto-1 protein and clinical pathological parameters in esophageal carcinoma tissue (n=41)

2.5 Cripto-1蛋白與N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的相關性 Spearman相關分析顯示，食管癌組織中Cripto-1的表達與N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達呈正相關(r=0.463，r=0.460，P＜0.05)，與E-鈣黏蛋白的表達呈負相關(r=－0.310，P＜0.05，表2)。

表2 食管癌中Cripto-1與N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的相關性分析Tab.2 The correlation between the expression of Cripto-1 and N-cadherin, E-cadherin, Vimentin in esophageal carcinoma

3 討 論

Cripto-1基因位于人常染色體3p21.3，是表皮生長因子-CFC家族成員之一，最先由人畸胎瘤cDNA文庫中分離出來，因此又稱TDGF-1，具有調(diào)節(jié)細胞分化及胚胎發(fā)育的功能。Cripto-1在成人組織中的表達水平非常低，但在細胞發(fā)生惡變時的表達水平明顯增高[3]。研究發(fā)現(xiàn)Cripto-1在多種惡性腫瘤，如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、皮膚黑色素瘤及口腔鱗狀細胞癌等組織中過表達，而在正常組織中不表達或低表達[3-5]，提示Cripto-1表達增高可能是這些惡性腫瘤發(fā)生過程中的早期事件。體外研究表明，過表達Cripto-1可提高人乳腺癌細胞的生長速度、抗凋亡及遷移、侵襲能力[6]；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，Cripto-1基因沉默后的人鼻咽癌CNE-2細胞小鼠移植瘤生長明顯受抑[7]。

本研究通過RT-PCR和Western blotting檢測41例食管癌患者的癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織中Cripto-1蛋白及mRNA表達情況，結(jié)果顯示，Cripto-1 mRNA及蛋白在食管癌組織中的表達均高于癌旁組織和正常食管黏膜組織(P＜0.05)，提示Cripto-1可能在食管癌的發(fā)生中發(fā)揮作用，檢測其表達水平可能為食管癌的早期診斷提供參考。

Cripto-1不僅與腫瘤的發(fā)生有關，還與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能有關[3]。本研究采用免疫組化方法檢測了Cripto-1在食管癌組織中的表達，并分析了其與患者臨床病理資料的關系，結(jié)果顯示Cripto-1在食管癌中的表達與患者的年齡、性別和浸潤范圍無明顯相關(P＞0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期(TNM)顯著相關(P＜0.05)，提示Cripto-1在食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能具有重要作用，檢測食管癌組織中Cripto-1表達水平可能對食管癌的惡性程度評估及預后判斷有一定參考價值。

Strizzi等[10]發(fā)現(xiàn)Cripto-1在體外鼠乳房上皮細胞和體內(nèi)鼠乳房腫瘤細胞中可通過調(diào)控EMT的發(fā)生而促進侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換成能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的細胞的過程，細胞在此過程中獲得浸潤和遷移的能力[11]。EMT是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的主要機制之一，以上皮細胞極性的消失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征[12-13]。E-鈣黏蛋白是常用的上皮標志物，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白是較為公認的間質(zhì)標記物。我們采用免疫組化檢測食管癌組織EMT標記物表達情況，并對Cripto-1與EMT標記物間的相關性進行分析，結(jié)果顯示食管癌組織中Cripto-1表達與N-鈣黏蛋白表達呈正相關(r=0.463，P＜0.05)，與波形蛋白表達呈正相關(r=0.460，P＜0.05)，與E-鈣黏蛋白表達呈負相關(r=－0.310，P＜0.05)，提示Cripto-1可能通過調(diào)控間質(zhì)和上皮細胞標記物的表達而促進EMT的發(fā)生，從而在食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Cripto-1在食管癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用，可為食管癌的早期診斷、分子靶向治療及預后判斷提供重要參考。EMT的發(fā)生是多種基因、蛋白和微環(huán)境共同作用的復雜過程，Cripto-1可能與受其調(diào)控的EMT共同參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但具體機制有待進一步研究。

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