王曉，劉妍，思蘭蘭，陳麗，白文林，劉立明，王嫣，許智慧，戴久增，姚增濤，徐東平

核苷(酸)類似物是目前臨床慢性乙型肝炎抗病毒治療的主要藥物，可有效抑制病毒復(fù)制，改善肝功能，延緩肝臟疾病的進(jìn)展，但其作用常因長期服藥引發(fā)的耐藥問題而部分甚至全部抵消[1-2]。阿德福韋酯(ADV)是繼拉米夫定(LAM)之后第二種應(yīng)用于臨床的抗病毒藥物，短期內(nèi)可有效抑制野生株和LAM耐藥株的復(fù)制，但長期服用易產(chǎn)生耐藥，其5年耐藥率可達(dá)29%[3]。經(jīng)典的ADV耐藥突變形式為rtA181V和rtN236T，關(guān)于rtN236位點(diǎn)的其他變異目前尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報道。本研究采用克隆測序方法對1例ADV治療失敗患者血清病毒池中的HBV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)基因變異進(jìn)行鑒定，在rtN236位點(diǎn)檢出了新變異形式rtN236V，并對其表型耐藥特點(diǎn)進(jìn)行分析，以期豐富臨床對ADV耐藥變異的認(rèn)識，并為臨床及時調(diào)整治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒購自北京天恩澤公司；XhoⅠ、SphⅠ內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自大連寶生物公司；pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司；pTriEx-HBV 1.1倍載體由法國里昂大學(xué)Zoulim教授惠贈；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自美國Roche公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購自上海復(fù)星公司?？寺y序由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.2 研究對象 解放軍302醫(yī)院2010年1月收治的1例48歲男性慢性乙型肝炎患者，HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性，無重疊或混合感染。診斷標(biāo)準(zhǔn)按2000年9月(西安)全國會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》[4]執(zhí)行，常規(guī)檢測項目由本院臨檢中心完成。該患者于2008年10月首次接受ADV抗病毒治療，15個月后出現(xiàn)病毒學(xué)突破和生化學(xué)突破，血清HBV DNA載量由陰性上升為2.41×105U/ml，ALT由29U/L上升為66U/L。

1.3 方法

1.3.1 HBV RT區(qū)基因突變及基因型分析 取凍存于－20℃的患者血清，提取HBV DNA，采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBV RT基因[5]。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA雙向測序，對rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250位的經(jīng)典LAM、ADV、恩替卡韋(ETV)相關(guān)耐藥位點(diǎn)進(jìn)行分析[6]。膠回收純化上述PCR產(chǎn)物，與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選34個菌落PCR鑒定陽性的樣品送測序并分析耐藥突變。按文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行HBV基因分型。

1.3.2 pTriEx-HBV 1.1倍重組載體構(gòu)建及鑒定 提取含rtN236V、rtN236T和rtA181V+N236V突變形式的質(zhì)粒及野生型質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ/SphⅠ雙酶切后連接至經(jīng)同樣酶切后的pTriEx-HBV 1.1載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，接種至LB固態(tài)瓊脂板(含100μg/ml氨芐西林)，37℃溫箱培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取克隆測序，對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，制備轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒備用。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表型耐藥分析 分別提取野生病毒株和突變株重組載體質(zhì)粒，用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑按每孔0.25μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4h后分別加入不同濃度的LAM(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)，ADV(0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)，ETV(0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替諾福韋(TDF)(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)，隔天換液，換液2次后即轉(zhuǎn)染第4天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測上清中HBV DNA含量(反映病毒復(fù)制力)，計算藥物半數(shù)有效劑量IC50及耐藥倍數(shù)(突變株與野生株IC50的比值)。

2 結(jié) 果

2.1 HBV RT區(qū)基因突變檢測及基因分型結(jié)果 測序分析顯示該患者HBV RT區(qū)耐藥突變?yōu)閞tN236V/T共存，在34個陽性克隆中，20個(58.8%)為rtN236V變異株，11個(32.4%)為rtN236T變異株，2個(5.9%)為野生株，1個(2.9%)為rtA181V+N236V變異株。分型結(jié)果顯示該患者為C2基因亞型HBV感染。

2.2 pTriEx-HBV 1.1倍重組載體的構(gòu)建及鑒定 如圖1所示，電泳結(jié)果顯示2個條帶，即約7000bp的載體片段和1000bp的HBV RT區(qū)片段，測序進(jìn)一步證實(shí)載體構(gòu)建成功。

圖1 4種重組載體的XhoⅠ/SphⅠ雙酶切鑒定Fig.1 Identification of four recombinant plasmids by XhoⅠ/SphⅠ dual-enzyme digestionM. Marker (1kb); 1. rtWT; 2. rtN236T; 3. rtN236V; 4. rtA181V+N236V

2.3 變異HBV復(fù)制力測定 實(shí)時熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示，野生株病毒復(fù)制力為(4.00±2.36)×107U/ml，rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V變異株的病毒復(fù)制力均有所降低，分別為野生株的89.43%、83.60%和75.44%。

2.4 表型耐藥結(jié)果分析 與野生株比較，rtN236T、rtN236V、rtA181V+N236V變異株對LAM、ETV、TDF三種藥物均敏感，而對ADV顯示出不同水平耐藥性。rtN236T株對ADV敏感性降低，其耐藥倍數(shù)(變異株EC50/野生株EC50)是野生株的4.75倍；rtA181V+N236V株的耐藥倍數(shù)為野生株的5.10倍；rtN236V株對ADV的敏感性介于rtN236T和野生株之間，其耐藥倍數(shù)為野生株的3.10倍(表1)。

表1 HBV各變異株及野生株對4種藥物的敏感性Tab.1 Susceptibility of wild-type and mutant HBV to LAM, ADV, ETV and TDF in vitro

3 討 論

核苷(酸)類似物是當(dāng)前臨床抗HBV治療最常用的藥物，其抗病毒作用靶位是HBV RT區(qū)，而對病毒復(fù)制初始模板細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA沒有直接抑制作用，因此需要長期用藥才可達(dá)到持久抑制病毒的目的[8]。HBV是高變異的DNA病毒，可在長期藥物和機(jī)體免疫壓力下發(fā)生適應(yīng)性變異，或因預(yù)存的極少量變異株獲得選擇性擴(kuò)增，使耐藥病毒逐漸成為優(yōu)勢種群，最終導(dǎo)致耐藥，而隨后的病毒學(xué)和生化學(xué)突破又加速了肝病的進(jìn)展，嚴(yán)重者甚至可引起肝衰竭[9]。ADV是繼LAM之后第二種應(yīng)用于臨床的核苷酸類藥物，因其可在短期內(nèi)有效抑制野生病毒及LAM耐藥病毒的復(fù)制而在臨床廣泛使用，但長期使用仍可引發(fā)耐藥。初治患者ADV的5年耐藥率為29%，針對LAM耐藥患者長期單藥ADV治療后ADV耐藥率明顯增加，4年累積可達(dá)43%[2,10-12]。

本例研究對象為2010年1月解放軍302醫(yī)院收治的48歲男性慢性乙型肝炎患者，服用ADV 15個月后出現(xiàn)病毒學(xué)突破，血清HBV DNA載量由陰性上升為2.41×105U/ml，ALT由29U/L上升為66U/L，克隆測序顯示病毒準(zhǔn)種池中含有大量rtN236V變異株，同時伴有rtN236T、rtA181V+N236V及野生株。已知rtA181V和rtN236T是經(jīng)典的ADV耐藥變異形式[3]，而目前國內(nèi)外未見有關(guān)rtN236位點(diǎn)其他變異的文獻(xiàn)報道，為鑒定新的rtN236V變異是否與ADV耐藥相關(guān)，我們進(jìn)一步分析了rtN236V變異株的體外病毒復(fù)制力及表型耐藥特點(diǎn)。

體外實(shí)驗結(jié)果顯示，與野生株相比，rtN236V、rtN236T、rtA181V+N236V變異株的復(fù)制力均有不同程度下降。表型耐藥結(jié)果顯示rtN236T、rtA181V+N236V和rtN236V變異株的EC50分別是野生株的4.75、5.10倍和3.10倍。臨床通常將抗病毒藥物的耐藥分為3個級別：耐藥倍數(shù)2~9倍為低水平耐藥，10~99倍為中等水平耐藥，大于100倍為強(qiáng)耐藥。但是這一劃分范圍在體外表型耐藥實(shí)驗中也存在例外，體外實(shí)驗中ADV敏感性小幅度的增長(2~9倍)即可導(dǎo)致耐藥[13]。該患者病毒池中大量存在的rtN236V變異株雖然單獨(dú)對ADV耐藥的貢獻(xiàn)較小(3.10倍)，但與經(jīng)典的rtA181V和rtN236T變異株共同存在時，會協(xié)同增加變異株對ADV的耐藥性(5.10倍)，最終導(dǎo)致患者對ADV耐藥，進(jìn)而出現(xiàn)后續(xù)的病毒學(xué)和生化學(xué)突破。

新的耐藥變異形式鑒定一般要滿足以下幾個過程：首先在臨床病例中發(fā)現(xiàn)與藥物應(yīng)用相關(guān)的變異；其次體外實(shí)驗證實(shí)突變株的病毒適應(yīng)力；然后表型耐藥實(shí)驗分析突變株對抗病毒藥物的耐藥倍數(shù)；最后通過長期大樣本的臨床觀察得出最終結(jié)論[14-15]?？傊?，本研究從1例ADV治療失敗的慢性乙型肝炎患者病毒池中鑒定的與rtN236T和rtA181V共同存在的rtN236V變異，可能是一個新的ADV耐藥變異形式。核苷酸類藥物治療過程中及時監(jiān)測耐藥基因變異，對于及時調(diào)整臨床治療方案、提高抗病毒療效具有重要意義。

[1] Zoulim F. Are novel combination therapies needed for chronic hepatitis B[J]? Antiviral Res, 2012, 96(2)∶ 256-259.

[2] Chen CW, Chen CX, Chen SJ. Drug resistance and administration of nucleoside(s) on the treatment of chronic hepatitis B[J]. Chin J Pract Intern Med, 2013, 33(1)∶ 82-91. [陳成偉, 陳從新, 陳士俊, 等. 核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志, 2013, 33(1)∶82-91.]

[3] Segovia MC, Chacra W, Gordon SC. Adefovir dipivoxil in chronic hepatitis B∶ history and current uses[J]. Expert Opin Pharmacother, 2012, 13(2)∶ 245-254.

[4] The Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology,and the Chinese Society of Hepatology of the Chinese Medical Association. Viral hepatitis management scheme[J]. Chin J Hepatol, 2000, 8(6)∶ 324-329. [中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)分會、肝病學(xué)分會. 病毒性肝炎防治方案[J]. 中華肝臟病雜志, 2000, 8(6)∶ 324-329.]

[5] Xu DP, Liu Y, Cheng J, et al. Multiple-site analysis of HBV drugresistant mutations in 340 patients with chronic hepatitis B [J].Chin J Hepatol, 2008, 16(10)∶735-738. [徐東平, 劉妍, 成軍,等. 340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位點(diǎn)耐藥相關(guān)突變分析[J]. 中華肝臟病雜志, 2008, 16(10)∶ 735-738.]

[6] Liu Y, Li QH, Li L, et al. Genotypic analysis of Entecavirresistant mutation of hepatitis B virus (HBV) in patients with chronic HBV infection[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(6)∶ 621-624. [劉妍, 李慶虹, 李樂, 等. 慢性HBV感染患者恩替卡韋基因型耐藥突變特征分析[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(6)∶621-624.]

[7] Liu Y, Zhong Y, Zou Z, et al. Features and clinical implications of Hepatitis B virus genotypes and mutation in basal core promoter/precore region in 507 Chinese patients with acute and chronic hepatitis B[J]. J Clin Virol, 2010, 47(3)∶ 243-247.

[8] Xu L, Li DY, Wu XY, et al. The changes of the levels of IL-12 and IL-6 in serum of the patients with Chronic Hepatitis B treated with auto-dendritic cell and Adefovir Dipivoxil unionly and clinical significance[J]. Acta Acad Med CPAF, 2011, 20(3)∶ 193-198. [徐麗, 李冬嚴(yán), 吳曉燕, 等. 自體樹突狀細(xì)胞聯(lián)合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎IL-12和IL-6的水平變化及臨床效應(yīng)[J]. 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011, 20(3)∶ 193-198.

[9] Kim JW, Lee HS, Woo GH, et al. Fatal submassive hepatic necrosis associated with tyrosine-methionine- aspartateaspartate-motif mutation of hepatitis B virus after long-term lamivudine therapy[J]. Clin Infect Dis, 2001, 33(3)∶ 403-405.

[10] Peters MG, Hann HW, Martin P, et al. Adefovir dipivoxil alone or in combination with lamivudine in patients with lamivudineresistant chronic hepatitis B[J]. Gastroenterology, 2004, 126(1)∶91-101.

[11] Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, et al. Longterm therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B for up to 5 years[J]. Gastroenterology, 2006, 131(6)∶1743-1751.

[12] Chen CH, Wang JH, Lu SN, et al. Characteristics of adefovir resistance in patients with or without lamivudine-resistant hepatitis B virus treated with adefovir∶ a 4-year experience[J].Liver Int, 2011, 31(2)∶ 206-214.

[13] Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV∶ standardization of nomenclature and assays and recommendations for management[J]. Hepatology, 2007, 46(1)∶254-265.

[14] Xu DP, Liu Y. A novel insight of understanding of mechanism of hepatitis B virus drug resistance by combining genotype resistant mutation detection and phenotype resistance analysis[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6)∶ 535-538. [徐東平, 劉妍. 結(jié)合基因型耐藥突變檢測與表型耐藥分析探索乙肝病毒耐藥的新認(rèn)識[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 37(6)∶ 535-538.]

[15] Ji D, Liu Y, Li L, et al. The rtL229 substitutions in the reverse transcriptase region of hepatitis B virus (HBV) polymerase are potentially associated with lamivudine resistance as a compensatory mutation[J]. J Clin Virol, 2012, 54(1)∶ 66-72.