孔漢金,張克山,劉永杰,尚佑軍,吳 斌,劉湘濤*
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730046;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430070)
差異蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是了解細(xì)胞功能和疾病發(fā)生過程的關(guān)鍵。比較不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)組差異表達(dá),鑒定和分析差異蛋白對(duì)細(xì)胞代謝的影響有助于揭示細(xì)胞的生理機(jī)能及疾病致病機(jī)理。依據(jù)各個(gè)細(xì)胞成份在空間結(jié)構(gòu)、功能和分布的不同,可將其劃分為不同的細(xì)胞區(qū)域或功能相關(guān)的蛋白復(fù)合體。目前,大多數(shù)蛋白組研究者以亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組作為切入點(diǎn),即先通過研究亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué),進(jìn)而將各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白組進(jìn)行整合分析,從而獲得對(duì)全細(xì)胞蛋白質(zhì)組的整體認(rèn)識(shí)。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組主要對(duì)亞細(xì)胞區(qū)室、細(xì)胞器、大分子結(jié)構(gòu)和多蛋白復(fù)合物所包含的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究分析,明確不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表達(dá)情況對(duì)亞細(xì)胞功能聯(lián)系的重大意義。本文就近年來亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究概況做一綜述,并對(duì)研究結(jié)果所揭示的生物學(xué)意義進(jìn)行了討論分析。
亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的提取和純化是亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)。蛋白常規(guī)差速離心結(jié)合密度梯度沉降分離方法應(yīng)用較為廣泛,其原理是根據(jù)不同亞細(xì)胞組分的密度和沉降系數(shù)來分離亞細(xì)胞組分。分離的先后順序依次為細(xì)胞核,線粒體,溶酶體與過氧化物酶體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體,最后為核糖體。細(xì)胞核與線粒體密度差異顯著,利用離心方法分離效果明顯,但其他細(xì)胞器間大小、密度相互重疊,密度梯度沉降時(shí)不同組分相互混合,難以達(dá)到完全分離的目的。相繼出現(xiàn)的分步抽提法,電泳分離法(高效密度梯度電泳和免疫自由流電泳)、免疫親和法、流式細(xì)胞法、雙向系統(tǒng)法和親和純化-免疫磁珠純化分離等方法極大地提高了不同細(xì)胞器的分離效率,并且某些分離方法能夠有效提取不同的亞細(xì)胞組分。Herrnstadt C等[1]利用免疫磁珠分離純化法分離到高純度的線粒體,后來該分離方法得到了廣泛應(yīng)用,高爾基體、過氧化物酶體、囊泡等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也相繼被分離純化。有時(shí)對(duì)于密度相近的細(xì)胞器,可通過與其他介質(zhì)混合使其密度間有顯著差異。例如,在提取質(zhì)膜亞細(xì)胞組分時(shí),可用陽(yáng)離子硅膠包被質(zhì)膜,使其與其他細(xì)胞器密度差異明顯,然后通過密度梯度離心使細(xì)胞質(zhì)膜得到高度純化。Abdolzade-Bavil A等[2]研制出基于微分洗滌劑分餾分離方法(DDF)的蛋白提取試劑盒,分離的亞細(xì)胞蛋白組分經(jīng)2-D電泳,形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和酶促反應(yīng)分析顯示出具有較高的效率和選擇性。用此方法提取保存多年的冰凍組織中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白組覆蓋率和蛋白定位信息幾乎沒有損失。也有人報(bào)道了利用洋地黃皂苷和去垢劑從培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞液中分別提取濃縮到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),胞膜和核以及一些不溶性蛋白,經(jīng)后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證提取效果較好。Kislinger T等[3]結(jié)合亞細(xì)胞器分離技術(shù)以及基于鳥槍測(cè)序的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠不同組織的4個(gè)主要細(xì)胞器蛋白含量,利用嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)篩選和機(jī)器識(shí)別方法,共鑒定到4 768種蛋白,其中3 274種蛋白得到確切的亞細(xì)胞定位,包括1 503種未知特征蛋白,然而通過比較之前報(bào)道的mRNA表達(dá)模式評(píng)估了這些蛋白的組織選擇性。該成果可為主要?jiǎng)游锬P偷慕M織和器官表達(dá)蛋白組提供可靠的參考。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性決定了單獨(dú)使用一種分離方法分離不同亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組效果往往不理想,亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離純化仍然是亞細(xì)胞蛋白組學(xué)研究的一大挑戰(zhàn)。
對(duì)分離的亞細(xì)胞蛋白組分進(jìn)行純度鑒定是亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究必不可少的步驟,通常結(jié)合形態(tài)學(xué)和生化方法驗(yàn)證提取蛋白的純度。目前,進(jìn)行純度評(píng)價(jià)的方法包括利用電子顯微鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),明確是否有其他組分污染;利用Western blot方法測(cè)定目的細(xì)胞器標(biāo)志酶含量和可疑污染細(xì)胞器的標(biāo)志酶含量,兩者的比值即為目的細(xì)胞器相對(duì)于整個(gè)勻漿液中的富集程度;利用特異性抗體檢測(cè)細(xì)胞器中特異性蛋白從而評(píng)價(jià)亞細(xì)胞成分的純度。Foster L J等[4]通過對(duì)肝臟細(xì)胞分離的亞細(xì)胞組分標(biāo)記酶或標(biāo)記蛋白的鑒定分析,驗(yàn)證了分離的蛋白組分別來之于相應(yīng)的10個(gè)不同亞細(xì)胞器。近年來,Andreyev A Y等[5]從 RAW264.7細(xì)胞中提取6種亞細(xì)胞組分(細(xì)胞核,線粒體,細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和微粒體),通過定量LC-MS蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了50種各細(xì)胞器的標(biāo)記酶來評(píng)價(jià)各亞細(xì)胞組分分離的純度。
細(xì)胞膜含有特定的蛋白受體,成為藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo),現(xiàn)已知細(xì)胞膜蛋白占整個(gè)藥物靶標(biāo)的70%左右。細(xì)胞膜蛋白因其具有兩性特征而難以提取、溶解和分離??墒走x用甲醇與碳酸氫氨抽提跨膜蛋白后再加入生物素標(biāo)記的半胱氨酸對(duì)膜蛋白進(jìn)行親和純化,可有效抽提膜蛋白。蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了細(xì)胞膜表達(dá)蛋白組的研究。Han C L等[6]應(yīng)用凝膠輔助消化法結(jié)合iTRAQ標(biāo)簽的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定量膜蛋白,共鑒定到520種膜蛋白,該法能從提取膜組分的19個(gè)TM螺旋的完整膜蛋白中檢測(cè)到跨膜肽段(TM)。細(xì)胞膜上含有疾病相關(guān)生物標(biāo)記物,利用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行分析,可找出疾病相關(guān)膜靶蛋白。Oh P等[7]對(duì)正常和患乳腺癌大鼠的肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行了差異蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)12種差異蛋白在腫瘤肺泡上皮細(xì)胞膜表達(dá)上調(diào),后來將抗膜聯(lián)蛋白A1抗體注射到腫瘤大鼠后發(fā)現(xiàn)患病大鼠腫瘤發(fā)生了遷移,此項(xiàng)研究表明膜聯(lián)蛋白A1為腫瘤標(biāo)記物。近幾年利用亞細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)尋找人類癌癥相關(guān)生物標(biāo)記物眾多研究報(bào)道中,提取細(xì)胞膜等亞細(xì)胞組分常作為必須考慮的研究對(duì)象。為鑒定與人類肝癌相關(guān)的有意義蛋白標(biāo)記物,Lee Y Y等[8]提取肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核和細(xì)胞骨架等亞細(xì)胞組分,利用凝膠電泳結(jié)合液相色譜分離-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)共鑒定到3 045個(gè)差異蛋白點(diǎn),用PLGEM統(tǒng)計(jì)分析法區(qū)分差異表達(dá)蛋白發(fā)現(xiàn)有21個(gè)蛋白可能與肝癌有關(guān)。通過進(jìn)一步的Western blot、免疫熒光分析和免疫組化方法證實(shí)HCC、MATR3、LETM1、ILF2和IQGAP2等5種蛋白與肝細(xì)胞癌變過程有關(guān),可作為肝癌細(xì)胞的分子標(biāo)記物。Burong L等[9]提取人類肺腫瘤和周圍正常肺組織細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行2-D電泳分離,經(jīng)MALDI-TOF-MS分析,鑒定了19個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中12個(gè)蛋白上調(diào),7個(gè)蛋白下調(diào),再經(jīng)RTPCR與Western blot驗(yàn)證了下調(diào)蛋白CTSD和上調(diào)蛋白HSP60,生物信息學(xué)分析推測(cè)這2個(gè)蛋白可作為診斷和治療肺癌以及解釋其致病機(jī)理的生物候選標(biāo)記。隨著更多的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立,將有更多的疾病相關(guān)生物標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)。
線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所,有細(xì)胞“動(dòng)力工廠”之稱。根據(jù)人類基因組序列估計(jì)線粒體蛋白大約有1 000~2 000種,已有700多種線粒體蛋白得到鑒定,其中只有13種線粒體蛋白是由線粒體自身DNA編碼。研究者構(gòu)建了許多不同物種線粒體蛋白表達(dá)譜和描述線粒體蛋白分類,功能及相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。早前有人報(bào)道利用蛋白組學(xué)技術(shù)建立的人類胎盤組織線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜,只鑒定出46種蛋白。后來Taylor S W等[11]采用SDS-PAGE分離人心肌線粒體蛋白后進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,共鑒定出615種蛋白,其中與氧化磷酸化相關(guān)蛋白占90%以上。對(duì)線粒體進(jìn)行大規(guī)模的蛋白組學(xué)分析可以獲得多種蛋白變化信息從而有助于揭示線粒體代謝紊亂疾病的致病機(jī)理。Spahr C S等[12]采用蒼術(shù)苷隔離線粒體引起轉(zhuǎn)運(yùn)孔復(fù)合物(PTPC)開放,結(jié)果鑒定出79種已知蛋白,其中21種蛋白與人表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)相配,還發(fā)現(xiàn)其中一些蛋白質(zhì)與細(xì)胞凋亡相關(guān)。Palmfeldt J等[13]等為揭示乙基丙二酸腦?。‥E)的致病機(jī)制,從EE患者的皮膚成纖維細(xì)胞提取線粒體與正常皮膚作蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)有7個(gè)線粒體蛋白差異表達(dá)顯著,其中乙醛脫氫酶X(ALDH1B)和細(xì)胞凋亡因子(AIFM1)與細(xì)胞解毒機(jī)能和凋亡有關(guān)。Chen Y J等[14]鑒定了胰腺腫瘤組織中與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的線粒體蛋白L28(MRPL28)和L12(MRPL12),經(jīng)后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些蛋白能降低線粒體活力,增加糖酵解,體外抑制細(xì)胞成長(zhǎng),體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)而推測(cè)非原癌基因突變引起的線粒體代謝改變可能是調(diào)控腫瘤細(xì)胞耗氧量的重要機(jī)制。Roxo-Rosa M等[15]比較正常人與鼻囊性纖維化病人(CF)的鼻細(xì)胞線粒體蛋白組學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)與機(jī)體慢性炎癥和氧化應(yīng)激損傷的蛋白差異表達(dá)顯著,而線粒體蛋白的低水平表達(dá)表明CF鼻細(xì)胞線粒體代謝發(fā)生了改變。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是參與蛋白質(zhì)合成、修飾與加工、新生肽鏈的折疊、組裝和運(yùn)輸,還具有合成膜脂、調(diào)節(jié)血糖和鈣離子濃度的作用。對(duì)亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)研究能獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)復(fù)合物的生化和細(xì)胞功能信息。Knoblach B等[16]對(duì)小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,結(jié)果鑒定了141個(gè)蛋白斑點(diǎn),其中6個(gè)未知蛋白,新發(fā)現(xiàn)的2種蛋白命名為ERp19和ERp46,氨基酸序列分析表明ERp19和ERp46分別含有1個(gè)和3個(gè)硫氧還原序列,為硫氧還原蛋白家族成員,隨后的Western blot和Northern blot試驗(yàn)表明,與其他組織比較,肝臟中這2種蛋白和其相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平均上調(diào),亞細(xì)胞定位顯示這2種蛋白都富集于肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡內(nèi),利用酵母遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERp46具有PD(二硫化物異構(gòu)酶)功能,而ERp19則沒有。為明確生理與病理狀態(tài)下胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白組學(xué)情況,Chen X等[17]利用iTRAQ 標(biāo)簽結(jié)合2DLC-MALDI-MS/MS蛋白組學(xué)技術(shù)定量比較患急性胰腺炎(AP)和正常大鼠胰腺中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白組學(xué)變化,共鑒定到469個(gè)差異蛋白點(diǎn),這些蛋白歸類于核糖體蛋白,易位子,分子伴侶,分泌性蛋白和脂質(zhì)酶類。共有37種表達(dá)顯著差異的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白包括消化酶類和翻譯調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞凋亡過程中具有重要生物學(xué)意義,而分子伴侶蛋白則變化輕微,進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎中Erp27、甘油三酯脂肪酶前體、和脯氨酰4-羥化酶3種蛋白表達(dá)下調(diào),纖維蛋白原α、β和γ鏈表達(dá)顯著上調(diào),這些結(jié)果表明細(xì)胞凋亡早期其粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白變化可能影響消化酶的合成與加工。
高爾基體是由許多扁平囊泡構(gòu)成,其功能是將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工,修飾,分類并呈送到細(xì)胞特定部位或分泌到細(xì)胞外。同時(shí)高爾基體也參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色。根據(jù)人基因組序列預(yù)計(jì)有1 000種高爾基體蛋白,但只有200種蛋白得到鑒定。關(guān)于哺乳動(dòng)物高爾基體表達(dá)蛋白組學(xué)研究能夠鑒定出亞細(xì)胞組分中新的蛋白質(zhì)。Bell A W 等[18]采用 TritonX-114對(duì)純化的鼠肝臟高爾基體蛋白分級(jí)后經(jīng)SDS-PAGE分離,再經(jīng)PMF和MS/MS分析共鑒定出81個(gè)蛋白,其中49個(gè)為含有跨膜區(qū)的整合膜蛋白,鑒定出的蛋白以高爾基駐留蛋白和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為主;此外還發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為34ku新的高爾基體相關(guān)蛋白質(zhì)GPP34,該蛋白隨后被研究者廣泛研究并作為高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的新成員。此外Wu C C等[19]對(duì)大鼠不同狀態(tài)下乳腺上皮細(xì)胞高爾基體進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)大鼠處于最大分泌時(shí)30種蛋白表達(dá)上調(diào),這些上調(diào)蛋白屬于調(diào)控蛋白,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白類。許多關(guān)于高爾基體的蛋白組學(xué)研究揭示了高爾基體具有精氨酸甲基化功能,后來Wu等對(duì)大鼠高爾基體進(jìn)一步分析,利用MudTIP技術(shù)共鑒定了421個(gè)蛋白質(zhì),其中一個(gè)推測(cè)為甲基轉(zhuǎn)移酶,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在高爾基體中有18個(gè)蛋白質(zhì)是精氨酸二甲基化的;接著Wu等又設(shè)計(jì)甲基化活性試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證,他們用甲硫氨酸和Triton-100溶液孵育高爾基體蛋白質(zhì),經(jīng)質(zhì)譜鑒定出3種甲基化蛋白。對(duì)不同生物體及不同生理、病理狀態(tài)高爾基體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究將會(huì)進(jìn)一步加深對(duì)高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)。Chen X等[20]為發(fā)現(xiàn)子代高爾基體合成需要細(xì)胞分裂時(shí)母代高爾基體分解和重新裝配的內(nèi)在分子機(jī)制,采用iTRAQ標(biāo)簽的定量蛋白組學(xué)技術(shù)檢測(cè)和分析大鼠有絲分裂間期和分裂期高爾基體膜的差異蛋白組,共有1193個(gè)蛋白點(diǎn)得到鑒定,這些蛋白歸類于高爾基體結(jié)構(gòu)蛋白、高爾基體駐留酶、SNAREs、Rab GTPases和細(xì)胞骨架蛋白;有86個(gè)蛋白經(jīng)Western blot驗(yàn)證在有絲分裂間期和分裂期表達(dá)差異顯著且有生物學(xué)意義,推測(cè)這些蛋白與細(xì)胞周期高爾基體的分解和從新裝配有關(guān)。隨著亞細(xì)胞器分離技術(shù)和純化技術(shù)的發(fā)展,對(duì)不同生物體及不同生理、病理狀態(tài)高爾基體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究將會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)。
細(xì)胞核是遺傳物質(zhì)儲(chǔ)存和復(fù)制的場(chǎng)所,是細(xì)胞遺傳性和代謝活動(dòng)的控制中心,在細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和分化中起著重要作用。Schirmer E C等[21]提取肝臟的核膜蛋白利用差減蛋白組學(xué)技術(shù)共鑒定了80個(gè)蛋白質(zhì),其中13個(gè)為已知核膜蛋白,67個(gè)為新蛋白,通過免疫定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)定位于核膜,其余59個(gè)蛋白尚需進(jìn)一步的功能和定位分析。對(duì)核孔復(fù)合體蛋白質(zhì)組成分析有利于對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。Rout M P[22]等借助不同緩沖體系和蔗糖密度梯度離心分離到高純度的酵母核孔復(fù)合體蛋白,經(jīng)鑒定得到174個(gè)蛋白,其中34個(gè)未知蛋白質(zhì),這些未知蛋白的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究核孔復(fù)合體在核內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用有重大意義。目前很多動(dòng)物遺傳疾病與核膜和核孔復(fù)合物的結(jié)構(gòu)異常有關(guān),核膜與核孔復(fù)合物聯(lián)系緊密。對(duì)核膜的比較蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鑒定到很多蛋白具有明顯的序列特性,而且這些蛋白質(zhì)對(duì)于核孔復(fù)合物行使其功能具有一定作用,特別是核膜組分富集的蛋白質(zhì)中含有苯丙氨酸-甘氨酸重復(fù)序列影響著核轉(zhuǎn)運(yùn)功能[23]。利用蛋白組學(xué)技術(shù)尋找和鑒定與細(xì)胞核相關(guān)的疾病生物標(biāo)記物也得到了廣泛研究。McKinney K Q等[24]等對(duì)人的胰腺癌細(xì)胞和正常胰腺細(xì)胞核進(jìn)行了差異蛋白組學(xué)分析,共鑒定到2393個(gè)差異蛋白點(diǎn),利用PLGEM統(tǒng)計(jì)分析有104個(gè)蛋白與胰腺癌有關(guān),其中一種重要的細(xì)胞凋亡抑制因子PEDF,免疫熒光定位試驗(yàn)表明該標(biāo)記物在胰腺癌細(xì)胞核中大量表達(dá),而在正常胰腺細(xì)胞胞質(zhì)中大量表達(dá),推測(cè)可作為人類胰腺癌診斷標(biāo)記。核仁是細(xì)胞核內(nèi)核糖體產(chǎn)生區(qū)域,介導(dǎo)核糖體生物發(fā)生和rRNA合成。Andersen J S[25]從HeLa細(xì)胞中提取核仁蛋白,鑒定的692個(gè)蛋白為核蛋白,鑒定出的蛋白能與90%已知酵母核蛋白相匹配,表明核仁蛋白高度保守。剪接體是位于胞核的多蛋白復(fù)合物,主要功能是執(zhí)行前mRNA內(nèi)含子的剪切。關(guān)于剪接體的亞細(xì)胞蛋白組學(xué)研究相對(duì)較少,但有報(bào)道指出利用親和層析法分離得到高純度的活性剪接體,接著通過蛋白組學(xué)技術(shù)共鑒定到145個(gè)剪接體蛋白,其中包含58個(gè)新的剪接體蛋白。
中心體是動(dòng)物細(xì)胞的微管組織中心,它通過對(duì)細(xì)胞骨架的影響參與細(xì)胞形狀,極性和運(yùn)動(dòng),且在細(xì)胞的分裂增殖中扮演重要作用。Andersen J S等[26]首次運(yùn)用SDS-PAGE結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)人中心體進(jìn)行了研究,利用蛋白質(zhì)校正譜圖分析法確證中心體蛋白,并建立了中心體定位蛋白在五個(gè)密度梯度組分中肽段豐度與峰面積蛋白相關(guān)圖譜,運(yùn)用PCP技術(shù)找到137種中心體相關(guān)組分,隨后利用免疫熒光方法驗(yàn)證了23種新的中心體蛋白質(zhì),同時(shí),還找到了一些與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì),如ALMS1蛋白。為了弄清中心體結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系的分子機(jī)理,最近Jakobsen L 等[27]利用PCP-SILAC質(zhì)譜技術(shù)對(duì)人細(xì)胞中心體作了蛋白組學(xué)研究,這些蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)一步促進(jìn)中心體蛋白的功能分析。中間體為在細(xì)胞分裂期出現(xiàn)的來自于中心紡錘體的結(jié)構(gòu),其參與細(xì)胞的有絲分裂,一般出現(xiàn)在2個(gè)子代細(xì)胞即將分裂前的連接處。Skop A R等[28]對(duì)哺乳動(dòng)物中間體進(jìn)行蛋白組學(xué)研究,鑒定了160種候選中間體蛋白質(zhì),運(yùn)用免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)10種蛋白定位于中間體,為了明確這些蛋白是否參與細(xì)胞有絲分裂,利用RNA干涉試驗(yàn)顯示80種蛋白與細(xì)胞有絲分裂有關(guān),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GRP94參與了細(xì)胞染色體分離。
近年來,亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,但同樣也面臨諸多挑戰(zhàn),一是高純度亞細(xì)胞器的獲得,二是低豐度蛋白的鑒定及鑒定出的蛋白亞細(xì)胞的真實(shí)定位。目前,利用各種物理、化學(xué)或生物的方法都很難提取分離到絕對(duì)純度的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),分離的蛋白很難100%確定來自于目標(biāo)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。另外,有些蛋白質(zhì)并不是固定存在于單個(gè)亞細(xì)胞位置上,而是動(dòng)態(tài)的在多個(gè)亞細(xì)胞位置間轉(zhuǎn)運(yùn),所以對(duì)于這種動(dòng)態(tài)分布的蛋白質(zhì)是混合污染還是有定位變化尚需進(jìn)一步研究。隨著差減蛋白質(zhì)組方法、蛋白質(zhì)校正圖譜、FFE、免疫純化技術(shù)、FAOS、LOPIT、PCP等方法的引入,以及生物信息學(xué)軟件對(duì)蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè),分離得到的亞細(xì)胞器純度正在逐步提高,得到的亞細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)也越來越可靠??梢灶A(yù)見的是,由于整個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性,隨著技術(shù)的發(fā)展,比較亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)將成為一個(gè)新的發(fā)展方向。
[1] Herrnstadt C,Clevenger W,Ghosh S S,et al.A novel mitochondrial DNA-like sequence in the human nuclear genome[J].Genomics,1999,60(1):67-77.
[2] Abdolzade-Bavil A,Hayes S,Goretzki L,et al.Convenient and versatile subcellular extraction procedure,that facilitates classical protein expression profiling and functional protein analysis[J].Proteomics,2004,4(5):1397-1405.
[3] Kislinger T,Cox B,Kannan A,et al.Global survey of organ and organelle protein expression in mouse:combined proteomic and transcriptomic profiling[J].Cell,2006,125(1):173-186.
[4] Foster L J,de Hoog C L,Zhang Y,et al.A mammalian organelle map by protein correlation profiling[J].Cell,2006,125(1):187-199.
[5] Andreyev A Y,Shen Z X,Guan Z Q,et al.Application of proteomic marker ensembles to subcellular organelle identification[J].Mol Cell Proteomics,2010,9(2):388-402.
[6] Han C L,Chien C W,Chen W C,et al.A multiplexed quantitative strategy for membrane proteomics:opportunities for mining therapeutic targets for autosomal dominant polycystic kidney disease[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(10):1983-1997.
[7] Oh P,Li Y,Yu J,et al.Subtractive proteomic mapping of the endothelial surface in lung and solid tumours for tissue-specific therapy[J].Nature,2004,429(6992):629-635.
[8] Lee Y Y,McKinney K Q,Ghosh S,et al.Subcellular tissue proteomics of hepatocellular carcinoma for molecular signature discovery[J].J Proteome Res,2011,10(11):5070-5083.
[9] Li B,Chang J,Chu Y,et al.Membrane proteomic analysis comparing squamous cell lung cancer tissue and tumour-adjacent normal tissue[J].Cancer Letters,2012,319(1):118-124.
[10] Chen X,Li J,Hou J,et al.Mammalian mitochondrial proteomics:insights into mitochondrial functions and mitochondria-related diseases[J].Expert Review Proteomics,2010,7(3):333-345.
[11] Taylor S W,F(xiàn)ahy E,Zhang B,et al.Characterization of the human heart mitochondrial proteome[J].Nat Biotechnol,2003,21(3):281-286.
[12] Spahr C S,Susin S A,Bures E J,et al.Simplification of complex peptide mixtures for proteomic analysis:reversible biotinylation of cysteinyl peptides[J].Electrophoresis,2000,21(9):1635-1650.
[13] Palmfeldt J,Vang S,Stenbroen V,et al.Proteomics reveals that redox regulation is disrupted in patients with ethylmalonic encephalopathy[J].J Proteome Res,2011,10(5):2389-2396.
[14] Chen Y J,Cairns R,Papandreou I,et al.Oxygen consumption can regulate the growth of tumors,a new perspective on the oarburg effect[J].PloS One,2009,4(9):e7033.
[15] Roxo-Rosa M,da Costa G,Luider T M,et al.Proteomic analysis of nasal cells from cystic fibrosis patients and non-cystic fibrosis control individuals:Search for novel biomarkers of cystic fibrosis lung disease[J].Proteomics,2006,6(7):2314-2325.
[16] Knoblach B,Keller B O,Groenendyk J,et al.ERp19and ERp46,new members of the thioredoxin family of endoplasmic reticulum proteins[J].Mol Cell Proteomics,2003,2(10):1104-1119.
[17] Chen X,Sans M D,Strahler J R,et al.Quantitative organel-lar proteomics analysis of rough endoplasmic reticulum from normal and acute pancreatitis rat pancreas[J].J Proteome Res,2010,9(2):885-896.
[18] Bell A W,Ward M A,Blackstock W P,et al.Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins[J].J Biol Chem,2001,276(7):5152-5165.
[19] Wu C C,Yates J R.Proteomic analysis of two functional states of the Golgi complex in mammary epithelial cells[J].Traffic,2000,1(10):769-782.
[20] Chen X,Andrews P C,Wang Y.Quantitative analysis of liver Golgi proteome in the cell cycle[J].Meth Mol Biol,2012,909:125-140.
[21] Schirmer E C,F(xiàn)lorens L,Guan T,et al.Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics[J].Science,2003,301(5638):1380-1382.
[22] Rout M P,Aitchison J D,Suprapto A,et al.The yeast nuclear pore complex:composition,architecture,and transport mechanism[J].J Cell Biol,2000,148(4):635-651.
[23] Batrakou D G,Kerr A R,Schirmer E C.Comparative proteomic analyses of the nuclear envelope and pore complex suggests a wide range of heretofore unexpected functions[J].J Proteomics,2009,72(1):56-70.
[24] McKinney K Q,Lee Y Y,Choi H S,et al.Discovery of putative pancreatic cancer biomarkers using subcellular proteomics[J].J Proteomics,2011,74(1):79-88.
[25] Andersen J S,Lam Y W,Leung A K,et al.Nucleolar proteome dynamics[J].Nature,2005,433(7021):77-83.
[26] Andersen J S,Wilkinson C J,Mayor T,et al.Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling[J].Nature,2003,426(6966):570-574.
[27] Jakobsen L,Vanselow K,Skogs M,et al.Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods[J].Embo J,2011,30(8):1520-1535.
[28] Skop A R,Liu H,Yates J,et al.Dissection of the mammalian midbody proteome reveals conserved cytokinesis mechanisms[J].Science,2004,305(5680):61-66.