王立宏，趙新燕，牛 力

（1.西北農(nóng)林科技大學醫(yī)院，陜西楊凌712100；2.青島市立醫(yī)院，山東青島266071）

心力衰竭（心衰）是各種心臟病的終末表現(xiàn)，對心衰的研究是心血管領域的熱點。臨床發(fā)現(xiàn)心衰患者在癥狀，預后等各方面女性要好于男性，女性心衰患者死亡的風險較男性滯后10年，提示性激素可能對心臟功能有影響［1］，目前已發(fā)現(xiàn)雌激素受體在心血管不同組織中均有分布［2］，Barrick C J等［3］認為雌激素對心血管有保護作用。本文擬通過觀察雌激素對壓力負荷增高所致的大鼠心衰模型的各項生理指標及心臟膠原含量的影響，以明確雌激素對心臟功能和心室重構(gòu)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性Sprague－Dawley（SD）大鼠，10周齡，體重為200g～250g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心，合格證號SCXK（軍）2007－007。

1.1.2 實驗藥品及試劑 標準顆粒性大鼠飼料購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心；羥脯氨酸試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，注射用青霉素，規(guī)格800萬單位／支（批號：國藥準字H20013036），華北制藥集團生產(chǎn)；水合氯醛（批號：國藥準字H37022673），青島宇龍海藻有限公司生產(chǎn)；苯甲酸雌二醇，1mg／mL（批號：國藥準字 H44022008），廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 實驗儀器 RM－6200型四導生理儀由日本光電公司生產(chǎn)；JH502型電子天平由上海精科天平廠生產(chǎn)；DU650紫外分光光度計由Beckman生產(chǎn)；此外尚使用了722光柵分光光度計、托盤天平、彎剪、刀片、刀柄、止血鉗、持針器、眼科剪、組織剪、開胸器、皮針、小圓針、縫線等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備和分組 參照文獻［4］的方法，制造大鼠心力衰竭模型。取SD雌性大鼠40只，80mL／L的水合氯醛，以5mL／kg的劑量給予腹腔注射，麻醉后，使之仰臥固定于大鼠手術臺上，腹部去毛，消毒之后，從劍突下打開腹腔，在腎動脈上方分離出一小段腹主動脈，在該處將去尖的7號針頭連同腹主動脈一起結(jié)扎，抽出針頭，形成腹主動脈部分狹窄，檢查腹主動脈通暢后，將內(nèi)臟恢復原位，青霉素10萬單位預防感染，關閉腹腔，大鼠醒后，重新放入籠中飼養(yǎng) ，分別作為雌性手術組、雌性手術組＋雌激素組（術后給與苯甲酸雌二醇注射液劑量為0.1mg／kg，隔日1次，肌肉注射。）。再取雌性的同源大鼠15只作為假手術組，假手術組除不結(jié)扎動脈血管外，其余處理步驟與手術組相同。

1.2.2 檢測時段的確定 記錄大鼠活動、飲食等行為的變化，大約10周后，造模大鼠少動，倦怠無力，食欲不振，紫紺，皮下水腫等心功能不全的癥狀愈加明顯。本試驗中選此時間段的大鼠做相關檢測。

1.2.3 血流動力學指標的檢測 取其中大鼠，麻醉后，經(jīng)肝素化，分離右頸總動脈，插管，連接RM－6200型四導生理儀分別測量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）及心室內(nèi)壓最大上升速率（＋dp／dtmax）心室內(nèi)壓最大下降速率（－dp／dtmax）。

1.2.4 左心室質(zhì)量指數(shù)的測定 用托盤天平將麻醉后的大鼠稱重后，迅速開胸取心臟，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，沿房室溝剪掉左右心房，剪掉大血管，并緊貼室間隔右側(cè)剪去右心室游離壁，將剩余部分用電子天平稱重，即為左心室質(zhì)量。左心室質(zhì)量除以體重即為左心室質(zhì)量指數(shù)LVMI（mg／g）。

1.2.5 左室膠原含量的測定 將大鼠處死取出心臟，分別稱左心室質(zhì)量，取左心室游離壁，按照羥脯氨酸試劑盒的操作要求檢測，使用722光柵分光光度計，在550nm的波長下比色，測得各管的吸光度，根據(jù)公式：組織中羥脯氨酸含量＝（測定管吸光度－空白管吸光度）÷（標準管吸光度－空白管吸光度）×標準管濃度（2μg／mL）÷蛋白含量（mg／mL）計算出羥脯氨酸的含量。羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%，羥脯氨酸的量乘以7.46即可得出膠原的含量。

1.2.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差（One－way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用q檢驗（Newman－Keuls法）。以P＜0.05作為有統(tǒng)計學差異的標準。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的一般情況

試驗期間，雌性手術組死亡4只，雌性手術＋雌激素組死亡3只，雌性假手術組大鼠均存活。第8周后結(jié)扎的各組大鼠開始出現(xiàn)毛發(fā)缺乏光澤、皮毛蒼白、眼瞼分泌物增多、進食減少、活動減慢、懶動、呼吸急促。

2.2 各組血壓、血流動力學指標

各組大鼠的血流動力學檢測結(jié)果，見表1。

各手術組較假手術組的SBP和DBP低，但差異不顯著。兩手術組較假手術組±dp／dt明顯降低，手術組之間由雌性手術組至雌性手術＋雌激素組有升高的趨勢，但差異不顯著。各手術組與假手術組在LVSP和LVEDP上差異顯著，雌性手術組與雌性手術＋雌激素組的差異也顯著。

表1 血流動力學指標的比較Table 1 Comparison of hemodynamics indexes

2.3 左心室質(zhì)量指數(shù)

左心室質(zhì)量指數(shù)可以反映出心肌發(fā)生肥大的程度。各組左心室質(zhì)量指數(shù)的差別均顯著；左心室質(zhì)量指數(shù)由大到小排列依次為：雌性手術組＞雌性手術＋雌激素組＞假手術組（表2）。

2.4 心臟膠原含量

心臟膠原含量各組間差異顯著（表2）。

3 討論

通過縮窄腹主動脈，引起心臟壓力負荷增高的方法復制大鼠心衰模型，在體研究雌激素對心衰大鼠心臟生理指標及膠原含量的影響。探討雌激素對心衰的作用。心肌損傷后的心肌重構(gòu)，是心衰的重要原因，心肌重構(gòu)時心肌細胞外基質(zhì)的膠原纖維聚集，可引起膠原含量增高。心臟成纖維細胞通過膠原的生成和降解調(diào)節(jié)心肌細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。因此心臟成纖維細胞的異常會導致心肌重構(gòu)，引起心臟各腔室大小的異常，造成心功能異常［5－6］。故心肌膠原含量的測定可顯示心肌重構(gòu)的程度。

表2 左心室質(zhì)量指數(shù)、左室膠原含量的比較Table 2 Comparison of LVMI and left ventricular hydroxyproline content

測定心衰模型的各項生理指標，結(jié)果顯示同期應用雌激素干預的雌性心衰大鼠顯著低于雌性心衰大鼠的左心室質(zhì)量指數(shù)；血流動力學方面，發(fā)現(xiàn)雌激素有降低血壓的趨勢，并且應用雌激素干預的雌性心衰大鼠其左室收縮末壓和舒張末壓顯著低于心衰大鼠組；心臟膠原含量的測定顯示各組差異顯著。這些結(jié)果均表明雌激素能夠防止心臟擴大，減輕心臟負荷，減輕心臟重構(gòu)，改善心功能并延緩心衰的發(fā)展［7］。

雌激素改善心功能的可能機制是：①雌激素可以抑制腎素－血管緊張素－醛固酮（RAAS）系統(tǒng)誘導的血管緊張素受體mRNA表達、信號轉(zhuǎn)導過程及胞外基質(zhì)的重構(gòu)，從而抑制成纖維細胞增殖及膠原合成［8］。預先以雌激素處理體外培養(yǎng)的心肌成纖維細胞可以顯著降低血管緊張素Ⅱ誘導的p38MAPK／NFKB信號通路激活，預防心臟成纖維細胞分化［9］。②雌激素受體是雌激素發(fā)揮生理作用的關鍵，雌激素受體數(shù)目不同及其激活后信號轉(zhuǎn)導途徑的不同對雌激素的作用至關重要。研究顯示，心臟的肌細胞和成纖維細胞可表達功能性受體與配體結(jié)合后激活下游靶基因。這些基因在左室肥厚、心肌細胞生存和凋亡、心肌成纖維細胞膠原產(chǎn)生中發(fā)揮作用，雌激素可以直接與兩類核內(nèi)雌激素受體結(jié)合，活化靶基因轉(zhuǎn)錄［10］。③雌激素可抑制心肌細胞的凋亡，其機制可能與 促 凋 亡 基 因c－fos表 達 有 關［11］。Patten R D等［12］探討17β－雌二醇替代治療對心肌細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)以生理濃度雌二醇治療可以迅速激活心肌內(nèi)Akt信號通路，從而抑制凋亡。

本文觀察了雌激素對心衰大鼠的作用，有助于探討心衰過程中的性別差異的原因，隨著對性別影響在心衰過程中的進一步了解，相信必將對心衰的治療產(chǎn)生積極的意義。

［1］ Dent M R，Elimban V，Malik A，et al.Cardiac Adaptations［M］.New York：Springer，2013：201－212.

［2］ Grohe C，Kahlert S，Lobbert K，et al.Cardiac myocytes and fibroblasts contain function estrogen receptors［J］.FEBS Letters，1997，416（1）：107－112.

［3］ Barrick C J，Lenhart P M，Dackor R T，et al.Loss of receptor activity－modifying protein 3exacerbates cardiac hypertrophy and transition to heart failure in a sex－dependent manner［J］.J Mol Cell Cardiol，2012，52（1）：165－174.

［4］ Anversa P，Hagopian M，Loud A V.Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy［J］.Lab Invest，1973，29（3）：282－292.

［5］ Lee C H，Hong C H，Yu H S，et al.Transforming growth factor－βenhances matrix metalloproteinase－2expression and activity through AKT in fibroblasts derived from angiofibromas in patients with tuberous sclerosis complex［J］.Bri J Dermatol，2010，163（6）：1238－1244.

［6］ Kakkar R，Lee R T.Intramyocardial fibro blast myocyte communication［J］.Circulation Res，2010，106（1）：47－57.

［7］ Allgood Jr O E，Hamad A，F(xiàn)ox J，et al.Estrogen prevents cardiac and vascular failure in the‘listless’zebrafish （Danio rerio）developmental model［J］.Gen Comp Endocrinol，2013，189（1）：33－42.

［8］ Kanashiro－Takeuchi R M，Heidecker B，Lamirault G，et al.Sex specific impact of aldosterone receptor antagonism on ventricular remodeling and gene expression after myocardial infarction［J］.Clin Translat Sci，2009，2（2）：134－142.

［9］ Wu M，Han M，Li J，et al.17beta－estradiol inhibits angiotensin II－induced cardiac myofibroblast differentiation［J］.Euro J Pharmacol，2009，616（1－3）：155－159.

［10］ Gardner J D，Murray D B，Voloshenyuk T G，et al.Estrogen attenuates chronic volume overload induced structural and functional remodeling in male rat hearts［J］.Am J Physiol，Heart and Circ Physiol，2010，298（2）：H 497－H504.

［11］ 朱艷霞，田宗文，朱紅霞，等.雌激素對培養(yǎng)心肌細胞肥大和凋亡的抑制作用［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2006，15（1）：72－76.

［12］ Patten R D，Karas R H.Estrogen replacement and cardiomyocyte protection［J］.Trends in Cardiovascular Medicine，2006，16（3）：69－75.