李 燕 徐 靜 吳祥庭 季燕珍

（1．溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 溫州 325006；2．溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325000）

在鹵制品加工的蒸煮取肉過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的鹵制加工的預(yù)煮廢棄液。這些廢棄液中含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，其中蛋白質(zhì)含量約為1．54g／100mL、脂肪含量約為1．0g／100mL、氨基酸含量約為0．06g／100mL。目前很多企業(yè)采用生化方法處理廢棄液，但是生化處理需要大量的人力和一定處理成本；也有些企業(yè)將廢棄液直接排放到環(huán)境中，這不僅造成資源的極大浪費(fèi)，而且對(duì)環(huán)境也產(chǎn)生了不良影響［1］。

目前有關(guān)鹵制加工廢棄液開發(fā)利用的研究很少。本課題組［1，2］曾采用陶瓷膜對(duì)鹵制加工廢棄液進(jìn)行微濾，再用納濾膜進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。本研究以此為基礎(chǔ)，以所得濃縮廢棄液為原料，利用單因素和Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)酶解液的抗氧化活性進(jìn)行研究，為深度開發(fā)鹵制加工廢棄液制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料及儀器

鹵雞腿預(yù)煮廢棄液：浙江省溫州市東甌食品有限公司，－20 ℃貯藏；

動(dòng)物蛋白水解酶：酶活力60萬U／g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

其他試劑：均為中國產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)室小型陶瓷膜和多功能膜：LNG－CM－101型，上海朗極化工科技有限公司；

自動(dòng)凱氏定氮儀：K－370型，瑞士BUCHI有限公司；

日立氨基酸分析儀：L－8800型，日本日立公司；

紫外可見分光光度計(jì)：752S型，上海凌光技術(shù)有限公司；

酸度計(jì)：DELTA320型，梅特勒－托利多國際股份有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－2型，國華電器有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 陶瓷膜微濾鹵雞腿預(yù)煮廢棄液 取一定量鹵雞腿預(yù)煮廢棄液，用300目網(wǎng)篩過濾，然后用孔徑0．22μm 陶瓷膜，在溫度50℃、操作壓力0．075MPa條件下過濾，去除廢棄液中的雜質(zhì)以及大分子物質(zhì)，以減少對(duì)納濾膜的污染［1］。

1．2．2 納濾膜濃縮鹵雞腿預(yù)煮廢棄液 微濾液再選用360Da的納濾膜，在操作壓力為1．5 MPa，操作溫度為40 ℃，pH 為6．0條件下，通過納濾膜濃縮廢棄液［2］。

1．2．3 鹵雞腿納濾濃縮液酶解單因素試驗(yàn) 以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別研究酶解時(shí)間、加酶量、初始pH 值、酶解溫度對(duì)酶解效果的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

（1）酶解時(shí)間：在酶解溫度50 ℃、初始pH 7．0、蛋白酶加酶量0．8%條件下，研究酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響。

（2）加酶量：在酶解溫度50 ℃、初始pH 7．0、酶解時(shí)間6h條件下，研究蛋白酶加酶量對(duì)水解度的影響。

（3）初始pH 值：在酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間6h、蛋白酶加酶量1．0%條件下，研究初始pH 對(duì)水解度的影響。

（4）酶解溫度：在酶解時(shí)間6h、蛋白酶加酶量1．0%、初始pH 7．0條件下，研究酶解溫度對(duì)水解度的影響

1．2．4 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)水解度影響較大的因素為自變量，根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［3，4］，以蛋白水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝條件。

1．2．5 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定 參照GB／T 5009．39－2003，采用甲醛滴定法。

1．2．6 總氮的測(cè)定 參照GB／T 5009．5－2010，采用半微量凱氏定氮法。

1．2．7 水解度（DH）的測(cè)定 水解度指水解斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比。水解斷裂的肽鍵數(shù)可通過水解放出的氨基氮數(shù)目來測(cè)定［5］。按式（1）計(jì)算水解度。

1．2．8 酶解液抗氧化活性的測(cè)定

（1）酶解液的還原能力［6］：取2．5mL不同濃度酶解液，加入2．5 mL 0．2 mol／L 的 磷 酸 鈉 緩 沖 液（pH 6．6）和2．5mL 1%的K3［Fe（CN）6］溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，加入2．5mL 10%的三氯乙酸，3 000r／min離心10 min，取5mL 上清液加去離子水5mL、0．1%的FeCl3溶液1mL，于700nm 處測(cè)定吸光度值。并用BHT 和VC作對(duì)照試驗(yàn)。

（2）酶解液對(duì)DPPH 清除力的測(cè)定［7］：取2 mL 樣品溶液，加入等體積0．8 mmol／mL 的DPPH 醇溶液，混勻后靜置30min，于517nm 處測(cè)定吸光度值。并用BHT 和VC作對(duì)照試驗(yàn)。按式（2）計(jì)算DPPH 清除率。

式中：

R——DPPH 清除率，%；

Ax—— 加入樣品溶液后的吸光度；

Ax0—— 樣品溶液本底的吸光度；

A0—— 空白對(duì)照液的吸光度。

1．3 數(shù)據(jù)分析

采用Design－Expert 6．0．5Trial軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 鹵制加工廢棄液的膜分離濃縮

鹵制加工廢棄液膜分離濃縮前后蛋白質(zhì)、游離氨基酸濃度的變化見表1。由表1可知，經(jīng)納濾膜濃縮后，鹵制加工廢棄液的蛋白質(zhì)濃度為8．43g／100 mL，游離氨基酸濃度為0．25g／100mL。后續(xù)試驗(yàn)以濃縮后的鹵制加工廢棄液進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

表1 膜分離濃縮后廢棄液各成分變化及濃縮倍數(shù)Table1 Components and concentration times of membrane separation and concentration

2．2 濃縮廢棄液酶解條件優(yōu)化

2．2．1 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖1可知，水解度隨酶解時(shí)間的延長而增大，并趨于一個(gè)穩(wěn)定值；而水解速率于反應(yīng)起始階段增加較快，隨后下降，6h后水解速率的增加明顯下降。考慮到生產(chǎn)成本及對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響，后續(xù)試驗(yàn)的酶解時(shí)間控制為6h。

2．2．2 加酶量對(duì)水解度的影響 由圖2可知，隨著加酶量的增加，酶對(duì)蛋白水解作用增強(qiáng)，水解度呈不斷上升的趨勢(shì)，體系水解度和水解速率均隨初始酶濃度的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)加酶量超過1．0%時(shí)，酶分子趨向飽和，繼續(xù)增大加酶量其影響不大，水解度上升趨勢(shì)變化緩慢。因此，加酶量控制在1．0%左右較為適宜。

2．2．3 初始pH 值對(duì)水解度的影響 初始pH 值會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，從而影響酶解反應(yīng)。由圖3 可知，隨著初始pH值的增加，水解度也在增加，但是在初始pH 值為7．0之后，水解度呈下降趨勢(shì)。這是由于酶有最適pH 值，若偏離最適pH 值，即改變?nèi)芤褐蠴H－濃度，會(huì)影響蛋白酶自身的解離和底物的解離，從而影響酶解反應(yīng)，使得酶的反應(yīng)速率受到抑制，酶解不充分［8］。因此，初始pH 值控制在7．0左右較為適宜。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Figure1 Effect of different time on the hydrolysis degree

圖2 加酶量對(duì)水解度的影響Figure2 Effect of enzyme ammount on hydrolysis degree

圖3 初始pH 值對(duì)水解度的影響Figure3 Effect of pH on the hydrolysis degree

圖4 酶解溫度對(duì)水解率的影響Figure4 Effect of temperature on the hydrolysis degree

表2 因素水平表Table2 Factors and levels of response surface methodology（RSM）

表3 Box－Bchnken設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果Table3 Program and experimental results of Box－Bchnken

2．2．4 酶解溫度對(duì)水解度的影響 由圖4可知，在一定的范圍內(nèi)，水解度隨著溫度的上升而不斷增加，但是超過60 ℃之后，水解度趨于緩慢增長且有下降的趨勢(shì)。其原因是溫度升高，反應(yīng)速度加快，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性，酶的穩(wěn)定性也會(huì)下降，酶解效率也隨之降低。因此，酶解溫度控制在60 ℃左右較為適宜。

2．2．5 鹵雞腿廢棄濃縮液酶解的響應(yīng)面試驗(yàn)分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、初始pH 值、加酶量3個(gè)因素為自變量，以蛋白水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)。試驗(yàn)因素的水平取值見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

利用Design－Expert 6．0．5Trial軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到動(dòng)物蛋白酶水解鹵雞腿廢棄濃縮液的回歸方程：

由表4可知，酶解溫度、初始pH 值和加酶量對(duì)水解度的影響顯著，三者之間交互作用也顯著。所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（P＜0．000 1）。失擬項(xiàng)在0．05水平上不顯著（P＝0．055 8＞0．05），其決定系數(shù)為0．998 6，校正決定系數(shù)為0．996 8，說明該模型能解釋99．68%。響應(yīng)值的變化，僅有總變異的0．32%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度較好，用該模型對(duì)鹵雞腿廢棄濃縮液酶解工藝研究進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table4 Variance analysis of ACE－inhibitory activity experiment

圖5 酶解溫度和初始pH 值對(duì)水解度影響的曲面圖及等高線圖Figure5 Response surface plot and contour map showing the effect of temperature and pH on hydrolysis degree

由圖5～7可知，酶解溫度與初始pH 值的交互作用對(duì)水解度的影響最大，初始pH 值和加酶量次之，酶解溫度和加酶量再次之。

2．2．6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design－Expert 6．0．5Trial軟件獲得了各個(gè)因素的最佳水解條件組合為酶解溫度59．74 ℃、初始pH值6．94、加酶量1．14%、酶解時(shí)間6h，在此水解條件下，水解度預(yù)測(cè)值為32．15%。為便于操作將最優(yōu)工藝組合修正為酶解溫度60℃、初始pH 值7、加酶量1．14%、酶解時(shí)間6h，以此工藝組合進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其實(shí)測(cè)得水解度為32．07%±0．47%，與理論預(yù)測(cè)值的誤差在±1%以內(nèi)，說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2．3 酶解液的抗氧化活性

2．3．1 酶解液的還原能力 以BHT 和VC為對(duì)照測(cè)定了酶解液的總還原力。由圖8可知，在40μg／mL時(shí)，酶解液的還原能力最強(qiáng)，吸光度值為2．27；之后，隨著酶解液濃度的增大，其還原能力稍有下降。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，酶解液的還原能力均優(yōu)于BHT 和VC，說明酶解液具有較強(qiáng)的還原能力，將其應(yīng)用于調(diào)味基料的制作，可提高調(diào)味料的抗氧化性。

2．3．2 酶解液對(duì)DPPH 清除作用 由圖9可知，在試驗(yàn)濃度范圍的酶解液對(duì)DPPH 清除率較大，均在80%以上，當(dāng)酶解液濃度為40μg／mL時(shí)，對(duì)DPPH 清除率最大，達(dá)到90%。在酶解液濃度小于60μg／mL時(shí)，酶解液對(duì)DPPH 的清除率明顯高于BHT 和VC；濃度大于60μg／mL 后，酶解液與BHT、VC對(duì)DPPH 清除效果的清除效果相差不大。說明酶解液具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基的能力。

圖6 酶解溫度與加酶量對(duì)水解度影響的曲面圖及等高線圖Figure6 Response surface plot and contour map showing the effect of temperature and enzyme amount on hydrolysis degree

圖7 初始pH 值與加酶量對(duì)水解度影響的曲面圖及等高線圖Figure7 Response surface plot and contour map showing the effect of pH and enzyme amount on hydrolysis degree

圖8 不同濃度酶解液、BHT 和VC 的還原能力比較Figure8 Comparison of reducing power between different concentration of enzymatic hydrolysate，BHT and VC

圖9 不同濃度酶解液、BHT 和VC 對(duì)DPPH 的清除率Figure9 Scavenging ability of different concentration enzymatic hydrolysate BHT and VCon DPPH scavvenging rate

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用陶瓷膜對(duì)鹵雞腿廢棄液進(jìn)行分離、納濾膜濃縮，重點(diǎn)探討了鹵雞腿廢棄濃縮液的酶解工藝條件，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，其最佳酶解工藝為酶解溫度60 ℃、初始pH 值7、加酶量1．14%、酶解時(shí)間6h，該條件下酶解液的水解度為32．07%±0．47%；酶解液具有較強(qiáng)的鐵還原能力和清除DPPH 自由基能力，是一種良好的抗氧化物質(zhì)。按本試驗(yàn)的方法制備的鹵雞腿廢棄濃縮液的酶解液可為新型天然調(diào)味料的開發(fā)提供基料，這既豐富了調(diào)味品市場(chǎng)，又為鹵制加工預(yù)煮廢棄液的回收利用提供了新的途徑。但關(guān)于鹵雞腿廢棄濃縮液的酶解液中的主要抗氧化成分還有待進(jìn)一步的研究。

1 李燕，鄭曉杰，黃雪飛，等．陶瓷膜在鹵制品加工廢棄液微濾中的應(yīng)用［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（1）：116～119．

2 李燕，鄭曉杰，吳澤威，等．鹵雞腿預(yù)煮廢棄液納濾濃縮工藝的研究［J］．中國調(diào)味品，2012（2）：86～88．

3 趙鴻霞，周大勇，秦磊，等．響應(yīng)面法優(yōu)化海參卵酶解工藝［J］．食品與機(jī)械，2010，26（5）：114～116．

4 E Turabi，G Sumnu，S Sahin．Optimization of baking of rice cakes in infrared－microwave combination oven by response surface methodology［J］．Food Bioprocess Technology，2008，1：64～73．

5 楊燊，郝更新，陳申如，等．藍(lán)圓鲹酶解條件的響應(yīng)面法優(yōu)化及其產(chǎn)物抗氧化活性的研究［J］．中國食品學(xué)報(bào)，2012，12（8）：32～40．

6 Lee Y L，Yen M T，Mau J L．Antioxidant properties of various extracts from hypsizigus marmoreus［J］．Food Chemistry，2007，104（1）：1～9．

7 Tsai S Y，Huang S J，Mau J L．Antioxidant properties of hot water extracts from agrocybe cylindracea［J］．Food Chemistry，2006，98（4）：670～677．

8 Qing Shen，Rui Guo，Zhiyuan Dai．Investigation of enzymatic hydrolysis conditions on the properties of protein hydrolysate from fish muscle （collichthys niveatus）and evaluation of its functional properties［J］．Agricultural and Food Chemistry，2012，60（20）：5 192～5 198．