楊趁仙陳復(fù)生劉昆侖布冠好郭 珍徐衛(wèi)河

YANG Chen－xian1CHEN Fu－sheng1LIU Kun－lun1BU Guan－h(huán)ao1GUO Zhen1XU Wei－h(huán)e2

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001）

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法有沉淀法、離子交換法、吸附法等［1－3］，但缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、效率低、能耗高、有溶劑殘留等，因此難以滿足現(xiàn)代生化分離的需要。20世紀(jì)70年代末新興的反膠束萃取技術(shù)適用于蛋白質(zhì)或酶類等大分子的分離純化，具有操作簡(jiǎn)單、萃取率高、可連續(xù)操作、不易引起目標(biāo)產(chǎn)物變性等優(yōu)點(diǎn)。近些年來，反膠束萃取技術(shù)已應(yīng)用于生物［4，5］、化工、食品［6］、材料、醫(yī)藥［7］等諸多方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。文章重點(diǎn)介紹了反膠束萃取蛋白質(zhì)的基本原理、主要影響因素及國(guó)內(nèi)外有關(guān)反膠束體系萃取植物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與特性的研究現(xiàn)狀。

1 反膠束體系的概念及萃取原理

反膠束（reverse micelle），又稱反膠團(tuán)，是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中形成的納米尺度的一種聚集體（10～100nm），反膠束溶液是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。

將表面活性劑添加到水或有機(jī)溶劑中，使其濃度超過臨界膠束濃度，表面活性劑就會(huì)聚集在一起，極性基團(tuán)向外，與水接觸，非極性基團(tuán)向內(nèi)，形成一個(gè)非極性核，稱為正膠束。若將表面活性劑添加在有機(jī)溶劑中，當(dāng)其濃度超過臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑的親水極性頭自發(fā)向內(nèi)，形成一個(gè)極性核，疏水非極性尾向外，與非極性的有機(jī)溶劑接觸，形成含有極性內(nèi)核的聚集體即為反膠束（見圖1）。水進(jìn)入此極性內(nèi)核后形成的“水池”具有增溶蛋白質(zhì)、酶、氨基酸等物質(zhì)的能力，增溶的過程稱為前萃（forward extraction）；將前萃液與另一水相接觸，改變水相條件（如pH值、離子種類或離子濃度等），使目標(biāo)產(chǎn)物從反膠束轉(zhuǎn)移到水相的過程，稱為后萃（backward extraction）。常用的有機(jī)溶劑有異辛烷、正辛烷等脂肪烷烴［8］；常用的表面活性劑有丁二酸－2－乙基已基酯磺酸鈉（AOT）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三辛基甲基氯化銨（TOMAC）等［9］。表面活性劑通常與某些有機(jī)溶劑配合使用［10］，見表1。

圖1 正常膠束與反膠束示意圖Figure1 Structure of micelle and reverse micelle

表1 反膠束萃取中常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑Table1 Surfactant used commonly and the corresponding organic solvent of reverse micelles

2 反膠束體系表征參數(shù)

描述反膠束體系的性質(zhì)通常用W0（或R）、θ和N等參數(shù)，其中W0表示形成反膠束微粒的水和表面活性劑的摩爾數(shù)比，θ（mol／L）表示增溶的水相對(duì)于有機(jī)相總體積的濃度，N表示組成反膠束微粒的表面活性的個(gè)數(shù)即聚集數(shù)。W0是衡量反膠束體系增溶能力最重要的參數(shù)，當(dāng)W0一定時(shí)，θ和N決定了反膠束微粒的相對(duì)濃度。

3 影響反膠束萃取的主要因素

3.1 表面活性劑的種類

表面活性劑是形成反膠束的主要成分，它是一種由親水的極性基團(tuán)和親油的非極性基團(tuán)組成的兩親分子［11］，可分為陰離子表面活性劑（如AOT，DBS，SDS）、陽離子表面活性劑（如CTAB，TOMAC）、兩性離子表面活性劑（如卵磷脂）和非離子型表面活性劑（如Tween－85、烷基酚聚氧乙烯醚）。

研究［12］發(fā)現(xiàn)，由兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的混合反膠束體系對(duì)蛋白質(zhì)的提取優(yōu)于單一的反膠束體系。趙曉燕等［13］用4種表面活性劑（AOT、CTAB、TritonX－100、SDS）形成的反膠束對(duì)大豆蛋白進(jìn)行提取，對(duì)水池 （W0）大小、蛋白質(zhì)提取率及蛋白質(zhì)亞基分子量進(jìn)行了比較，得出AOT、SDS、CTAB和TritonX－100反膠束體系提取大豆蛋白質(zhì)的最佳濃度分別為0.08，0.08，0.08，0.10g／mL。孫秀平等［14］研究了 AOT、SDS、CTAB和 TritonX－100表面活性劑形成的反膠束對(duì)花生蛋白提取率的影響，結(jié)果表明不同的表面活性劑形成反膠束的“水池”大小不同，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率也不同。郭珍等［15］研究發(fā)現(xiàn)，用AOT、SDS與異辛烷正辛醇復(fù)合反膠束體系萃取花生蛋白，不僅萃取率有所提高，萃取時(shí)間也顯著縮短，萃取效果顯著優(yōu)于單一反膠束體系。

3.2 表面活性劑的濃度

表面活性劑的濃度直接影響體系界面膜的穩(wěn)定性、反膠束基團(tuán)聚集數(shù)和萃取效率。當(dāng)表面活性劑濃度過低時(shí)，難以形成穩(wěn)定的反膠束微乳液；濃度過高且體系水分含量不變時(shí)，W0值變小，則反膠束尺寸減小，由于空間位阻作用使蛋白質(zhì)增溶到反膠束內(nèi)受阻，導(dǎo)致蛋白質(zhì)萃取率下降；在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，隨著表面活性劑濃度的增大，萃取率也不斷提高［16］。

任健等［17］研究了不同濃度AOT反膠束溶液對(duì)玉米胚芽蛋白前萃率的影響，結(jié)果顯示當(dāng)AOT濃度增加，反膠束的W0值、水池直徑及體系相對(duì)黏度增加，蛋白質(zhì)的前萃率也增加，并確定了AOT濃度為0.044g／mL時(shí)前萃率最高，但隨著AOT濃度再增加，玉米胚芽蛋白的前萃率有所下降，這可能是由于AOT濃度過高對(duì)蛋白質(zhì)的增溶起到了阻礙作用。孫曉宏［18］研究了不同AOT濃度對(duì)小麥胚芽蛋白前萃率的影響，前萃率隨AOT濃度增加有顯著增加趨勢(shì)，但增加到一定程度時(shí)，趨勢(shì)有所下降最后趨于平衡。

3.3 水相pH值

水相pH值的改變直接影響蛋白質(zhì)表面的電荷情況，若蛋白質(zhì)表面凈電荷與表面活性劑頭部基團(tuán)的電性相反，它們之間就存在靜電吸引。當(dāng)水相pH小于等電點(diǎn)（pI）時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，使用陰離子表面活性劑，有利于蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束中；若使用陽離子表面活性劑，則相反［10］。pH大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷。

3.4 離子強(qiáng)度

水相中離子強(qiáng)度的大小決定帶電表面所賦予的靜電屏蔽程度，主要表現(xiàn)為降低帶電分子和反膠束帶電界面之間的靜電相互作用；降低表面活性劑頭部基團(tuán)之間的靜電排斥力，使反膠束顆粒變小，W0值減小。因此，降低水相的離子強(qiáng)度，有利于極性物質(zhì)在反膠束中的增溶［10］。

3.5 溫度

溫度也會(huì)影響反膠束的萃取率。在反膠束體系中，溫度升高，表面活性劑與水的親和力減小，導(dǎo)致反膠束水池直徑減小，W0值降低。溫度過高，反膠束體系不穩(wěn)定，且蛋白質(zhì)也易產(chǎn)生變性。

此外，蛋白質(zhì)的大小、濃度、表面的電荷分布及外界因素等也影響反膠束的萃取效率。

4 反膠束萃取植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特性的研究

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)其功能特性有著直接影響，而不同的萃取環(huán)境會(huì)不同程度的改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，如溶液中離子強(qiáng)度、pH值等因素會(huì)使反膠束中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響了蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)［19－21］，內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)的凝膠特性、起泡性、乳化性、持水性等功能特性的變化。目前可以用多種技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行測(cè)定，如掃描電鏡、氨基酸分析儀、X射線衍射、核磁共振、紅外光譜圖、拉曼光譜分析等［22－26］。近年來，一些學(xué)者采用上述方法對(duì)反膠束萃取的植物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并與傳統(tǒng)的堿溶酸沉提取法提取的蛋白質(zhì)對(duì)比，以探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化特性的變化。

4.1 反膠束萃取法對(duì)植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

反膠束“水池”增溶蛋白質(zhì)的驅(qū)動(dòng)力主要包括疏水力、靜電作用以及羥基間的相互作用，這些作用都可能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生重要影響［27］。此外，外界條件如pH值、離子強(qiáng)度等也會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)［28］。因此對(duì)反膠束萃取的植物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究顯得尤為重要，這也為研究萃取物的功能特性奠定了基礎(chǔ)。

Chang等［29］較早地利用傅里葉變換紅外光譜測(cè)定含重水的AOT／異辛烷反膠束萃取的α－胰凝乳蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過紅外酰胺I帶子峰的位置和強(qiáng)度判斷蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，也可估測(cè)反膠束萃取條件下α－胰凝乳蛋白酶不同結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。結(jié)果表明，反膠束萃取的α－胰凝乳蛋白酶結(jié)構(gòu)中α－螺旋和β－折疊比例減少，而無規(guī)則結(jié)構(gòu)增多，這可能會(huì)使α－胰凝乳蛋白酶有更多的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露出來，從而改變了酶的活性。之后，Chen等［30］采用紅外光譜技術(shù)對(duì)AOT反膠束萃取的大豆蛋白的特性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示水相萃取法與AOT反膠束萃取法得到的大豆蛋白其紅外譜圖上4 000～400cm－1處的峰強(qiáng)度和位置有所不同，且α－螺旋、β－折疊及不規(guī)則構(gòu)象的比例均有差異，這些改變均可能影響大豆蛋白的功能特性。Zhao等［31］應(yīng)用拉曼光譜對(duì)反膠束萃取大豆蛋白的主側(cè)鏈構(gòu)象變化進(jìn)行研究，通過與水相萃取對(duì)比發(fā)現(xiàn)，反膠束萃取的球蛋白分子的無序程度增加，并且出現(xiàn)一些新鍵；且此法萃取的7s和11s球蛋白主側(cè)鏈的構(gòu)象、α－螺旋、β－折疊及規(guī)則構(gòu)象所占比例也都有變化。高亞輝等［32］采用不連續(xù)SDS－PAGE和氨基酸分析對(duì)AOT／異辛烷反膠束萃取和堿溶酸沉法生產(chǎn)的大豆蛋白進(jìn)行了組分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反膠束萃取小分子蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng)，且其中α－螺旋和β－折疊含量低于大豆分離蛋白。反膠束萃取的蛋白中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和色氨酸的含量高于堿溶酸沉法生產(chǎn)的大豆分離蛋白。

總體看來，在反膠束萃取的特殊微環(huán)境下，得到的蛋白質(zhì)孔徑較?。坏鞍追肿拥闹麈湹摩粒菪?、β－折疊和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有一定程度的減少，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，側(cè)鏈基團(tuán)也有微小變化；反膠束萃取對(duì)蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的影響不大，甚至有利于提高某些氨基酸的含量，這可以改良蛋白質(zhì)的功能特性。蛋白質(zhì)的基團(tuán)和微觀結(jié)構(gòu)的改變表明反膠束體系與蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用，如蛋白質(zhì)的羥基、氫鍵與表面活性劑之間的作用，有機(jī)溶劑、蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)與表面活性劑之間的作用等，這些作用都對(duì)蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響。

4.2 反膠束萃取法對(duì)植物蛋白質(zhì)功能特性的影響

中國(guó)植物蛋白資源豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被廣泛應(yīng)用于乳制品加工、肉制品中、烘焙食品及面制品中、罐頭食品、飲料生產(chǎn)和保健食品等行業(yè)［33，34］。對(duì)反膠束萃取法分離的植物蛋白質(zhì)的功能特性進(jìn)行研究，有利于改善植物蛋白在生產(chǎn)應(yīng)用中的穩(wěn)定性、乳化性、發(fā)泡性等性能，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、消化利用率和保健功效，更好地滿足消費(fèi)者的需求。

陳復(fù)生等［35］分別用超聲輔助 AOT／異辛烷反膠束、AOT／異辛烷反膠束和堿溶酸沉法提取大豆蛋白，并研究了其功能性差異。結(jié)果表明超聲輔助反膠束萃取的大豆蛋白不僅蛋白質(zhì)含量高，且持水性、起泡性及其穩(wěn)定性、乳化性及其穩(wěn)定性均優(yōu)于其他兩種蛋白，但溶解性略低于AOT／異辛烷反膠束萃取的大豆蛋白。通過電子顯微鏡掃描儀觀察發(fā)現(xiàn)3種蛋白的微觀結(jié)構(gòu)均不相同，表明在反膠束和超聲波的特殊環(huán)境中，蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而影響了其功能性質(zhì)。Zhu等［36］在研究反膠束萃取的脫脂小麥胚芽蛋白的功能特性時(shí)指出，分離的小麥胚芽蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性高于蛋清標(biāo)準(zhǔn)，是一種高潛力蛋白，有望成為雞蛋蛋白的廉價(jià)替代品。

4.3 反膠束萃取法對(duì)植物蛋白質(zhì)物理性質(zhì)的影響

食品加工過程中，蛋白質(zhì)受熱內(nèi)部氫鍵斷裂，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開，這個(gè)過程需要吸熱，稱之為變性熱。蛋白質(zhì)分子變性過程會(huì)伴隨著能量的變化，差示掃描量熱法（DSC）可以對(duì)其進(jìn)行測(cè)量［37］。因此，研究反膠束萃取的植物蛋白質(zhì)的熱特性和流變學(xué)特性對(duì)其功能特性的分析以及進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

Zhao等［38］用DSC分析了兩種萃取方法（AOT反膠束萃取、水相萃?。┇@得的7s、11s球蛋白熱特性和流變學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者萃取的7s、11s的變性溫度和轉(zhuǎn)變焓與水相萃取的均不相同。AOT反膠束萃取法不影響11s的凝膠特性，但7s受到影響。反膠束萃得的7s球蛋白的硬度、彈性、粘附性和咀嚼性均低于傳統(tǒng)水溶液萃取的，但膠黏性稍高。李飛等［39］用DSC對(duì)反膠束萃取玉米胚芽蛋白熱特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在吸熱過程中，分子結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o序，熱變性溫度和變性焓較高，說明反膠束萃取的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，穩(wěn)定性好。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法相比，反膠束體系萃取的蛋白質(zhì)并沒有發(fā)生較大的變性，根據(jù)萃取的蛋白種類不同，其凝膠性、咀嚼性、彈性、粘附性等受到了一定程度的影響。研究萃取蛋白的熱特性和流變學(xué)特性對(duì)其應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)中有著重要意義，不僅可以提高資源利用率，還可以改善產(chǎn)品風(fēng)味口感，增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［40］。

5 結(jié)束語

反膠束萃取技術(shù)在植物蛋白質(zhì)的提取方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，而且具有廣闊的應(yīng)用前景。但反膠束萃取技術(shù)由于條件限制，尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而且萃取過程中還存在一些問題亟待克服：① 有機(jī)溶劑和表面活性劑仍有殘留，需研究開發(fā)一種天然安全的新型反膠束體系，以滿足工業(yè)生產(chǎn)安全性的要求；②反膠束萃取引起植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的原因尚不明確，需進(jìn)一步研究萃取物的微觀結(jié)構(gòu)和特性，并與傳統(tǒng)方法對(duì)比分析反膠束萃取法的優(yōu)劣；③ 反膠束萃取的傳質(zhì)模型仍未確定，需深入研究反膠束萃取過程提出傳質(zhì)模型并驗(yàn)證。以上問題的解決有助于提高反膠束萃取效率，優(yōu)化反膠束萃取工藝，為植物蛋白質(zhì)的提取提供一種重要方法，也為反膠束萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

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