劉金英，馬 薇，張 煦

(1.西北民族大學醫(yī)學院形態(tài)學教研室;2.蘭州大學基礎醫(yī)學院病理學研究所;甘肅蘭州，730030)

TSLC1(tumor suppressor in lung cancer 1，TSLC1)屬腫瘤抑制基因，研究發(fā)現，惡性腫瘤中存在TSLC1 基因表達降低或缺失，并且與腫瘤侵襲轉移密切相關［1］;并且TSLC1 基因表達缺失多與啟動子甲基化狀態(tài)相關［2］。卵巢癌是女性常見生殖系統腫瘤，較早發(fā)生侵襲和轉移，嚴重威脅婦女的健康。本研究旨在探討TSLC1 基因在卵巢癌細胞系中CPG 位點的甲基化狀態(tài)及該基因的表達情況，為尋找卵巢癌基因治療的靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑:DNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒和RT-PCR 試劑盒(Promega 公司);McCOY's 5A 培養(yǎng)基(Sigma 公司);Trizol 試劑(Invitrogen 公司);DMEM/HamF12 培養(yǎng)基(Thermo公司);胎牛血清(Hyclone 公司);兔抗人TSLC1 單克隆杭體(Abcam 公司);引物合成(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):人卵巢癌細胞系ES-2，SK-OV-3 細胞于McCOY's 5A 培養(yǎng)液(內含10% FBS)，JHOS-3 細胞系于DMEM/F12 培養(yǎng)液(DMEM∶HamF12 =1∶1，含15% FBS)，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)。ES-2，SK-OV3 細胞5 d傳代1 次，JHOS-3 細胞9 d傳代1 次，以對數生長期細胞為實驗細胞。

1.2.2 生物信息學分析:通過NCBI、MethPrimer 進行啟動子CpG 位點分析。Primer Premier 5.0 軟件設計RT-PCR 引物，MethPrimer 設計MSP 的特異性引物。

1.2.3 DNA 的提取及MSP:DNA 提取依試劑盒說明書。Epitect Bisulfite Kit 對基因組DNA 進行亞硫酸鹽修飾與純化。純化后的DNA 作為模板，EpiScope@ MSP kit 進行MSP反應。MSP 甲基化引物序列:上游5'-AGTGACGGAAATTTG TAACG-3'，下游:5'-AAAAACTCGAACTCCAAAAAACG-3';MSP 非甲基化引物序列:上游:5'-AGTGATGGAAATTTGTAA TG-3'，下游:5'-AAAAACTCAAACTCCAAAAAACA-3'，產物片段長173 bp。取5 μL PCR 產物3%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，Bio-Rad 成像系統采集圖像。

1.2.4 RNA 提取及反轉錄:用Trizol 試劑提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。TSLC1 引物序列上游:5'-GGTGATGGGCAGAATCTGTTTAC-3'，下游:5'-ACCAGGACTG TGATGGTGGTGT-3'，產物片段302 bp;β-actin 引物序列:上游:5'-AAATCTGGCACCACACCTT-3'，下游:5-AGCACTGTGTT GGCGTACAG-3'，產物片段500 bp。擴增產物2%的瓊脂糖凝膠電泳，采集圖像，Quantity one 軟件進行分析，以TSLC1/β-actin條帶吸光度的比值作為相對表達水平。

1.2.5 Western blot 檢測TSLC1 蛋白表達:RIPA 裂解液提取各細胞系總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。經SDS-PAGE 分離后轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，經BeyoECL Plus 化學發(fā)光法顯影，采集圖像，條帶分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MSP 檢測:TSLC1 基因啟動子在SK-OV3 和JHOS-3 細胞系中為甲基化的狀態(tài)，在ES-2 細胞系中為非甲基化的狀態(tài)(圖1)。

2.2 TSLC1 mRNA 在各細胞系中的表達:TSLC1 mRNA 在ES-2 細胞系陽性表達，在SK-OV3 和JHOS-3 細胞系中表達缺失，3 種卵巢癌細胞系中mRNA 表達差異有統計學意義(P＜0.01)(圖2A，表1)。

2.3 TSLC1 蛋白在各細胞系中的表達:ES-2 細胞系中TSLC1 蛋白表達，而SK-OV3 和JHOS-3 中的TSLC1 蛋白表達量極低，檢測結果同RT-PCR 相符合，TSLC1 蛋白在3 種卵巢癌細胞系中表達差異具有統計學意義(P＜0.01)(圖2B，表1)。

圖1 ES-2，SK-OV3 和JHOS-3 細胞系中TSLC1基因啟動子甲基化狀態(tài)Fig 1 The methylation of TSLC1 gene promoter in ovarian cancer cell lines

表1 各細胞系中TSLC1 mRNA 及蛋白的相對表達水平Table 1 TSLC1 mRNA and protein relative expression level in ovarian cell lines(±s，n=3)

表1 各細胞系中TSLC1 mRNA 及蛋白的相對表達水平Table 1 TSLC1 mRNA and protein relative expression level in ovarian cell lines(±s，n=3)

*P＜0.01 compared with SK-OV3 and JHOS-3;#P＜0.01 compared with SK-OV3 and JHOS-3;n．s．negative．

cell lineTSLC1 mRNATSCL1 protein ES-20.876 +0.146*0.827 +0.042#SK-OV3n．s．0.034 +0.001 JHOS-3n．s．0.073 +0.001

3 討論

圖2 TSLC1 基因和蛋白在ES-2，SK-OV3，JHOS-3細胞系中的表達Fig 2 The expression of TSLC1 mRNA and protein in ovarian cancer cell lines

抑癌基因的丟失或失活可能導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在抑癌基因失活發(fā)生過程中，啟動子區(qū)CpG 島甲基化是一個重要機制。文獻報道，TSLC1 基因在多種惡性腫瘤中存在CpG島甲基化，導致基因表達缺失［3］。本研究發(fā)現SK-OV3，JHOS-3 細胞系中TSLC1 基因啟動子發(fā)生甲基化，相應的mRNA 和蛋白表達陰性;在ES-2 細胞系中該基因正常表達。由于SK-OV3 和JHOS-3 細胞系均屬于卵巢腺癌，ES-2 細胞系屬于透明細胞癌;提示:在不同病理分型的卵巢癌中TSLC1 基因可能發(fā)揮不同的作用。對于TSLC1 基因去甲基化后是否再次表達，是否恢復其抑癌作用，從而作為基因治療的新靶點;而不同組織來源的卵巢癌病變中，TSLC1 在發(fā)揮何種功能，對這些問題有待進一步探索和研究。

［1］Liang QL，Chen GQ，Li ZY，et al．Function and histopathology of a cell adhesion molecule TSLC1 in cancer［J］．Cancer Invest，2011，29:107－112．

［2］Chen K，Wang G，Peng L，et al．CADM1/TSLC1 inactivation by promoter hypermethylation is a frequent event in colorectal carcinogenesis and correlates with late stages of the disease［J］．Int J Cancer，2011，128:266－273．

［3］李亮，王俊和，抑癌基因TSLC1 及其甲基化［J］．華西醫(yī)學，2010，1:241－243．