李勇，馮秀娥，梁泰剛，李青山

(山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001)

HPLC測(cè)定2,5’-二溴-4,5,2’-三羥基二苯甲酮原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)

李勇，馮秀娥，梁泰剛，李青山*

(山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001)

目的 建立HPLC測(cè)定海洋來(lái)源活性化合物2,5’-二溴-4,5,2’-三羥基二苯甲酮原料藥(LM49)的含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。方法 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-乙腈-水(磷酸調(diào)pH至3.0)(70∶10∶20)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為261 nm，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃。結(jié)果 主峰能與雜質(zhì)峰達(dá)到良好分離，LM49在濃度1.0～100 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，最低檢測(cè)限為0.02 mg·L-1，平均回收率為99.8%(RSD=0.88%)。結(jié)論 本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于LM49原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

高效液相色譜法；2,5’-二溴-4,5,2’-三羥基二苯甲酮；有關(guān)物質(zhì)；含量測(cè)定

2,5’-二溴-4,5,2’-三羥基二苯甲酮(LM49)為課題組自主合成、具有全新結(jié)構(gòu)的海洋來(lái)源溴酚化合物，其對(duì)過(guò)氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用[1]，提示該化合物對(duì)心腦血管疾病有較強(qiáng)的應(yīng)用開發(fā)前景。由于LM49為本課題組自主合成，目前還沒(méi)有建立含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立與質(zhì)量控制是其后續(xù)系統(tǒng)研發(fā)工作的基礎(chǔ)，為使LM49的質(zhì)量可控并為后續(xù)研究提供質(zhì)量穩(wěn)定的樣品，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)LM49原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)的檢查進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，所建立的方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分離度好，可有效檢測(cè)原料藥中LM49的含量并對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；BT25S型電子天平(德國(guó)Sartorius)；LM49對(duì)照品(以鄰甲氧基苯甲酰氯與1,2-二甲氧基苯為起始原料自制，經(jīng)3次重結(jié)晶，面積歸一化法測(cè)定其純度≥99.85%)；LM49供試品(自制，批號(hào)：20120302，20120511，20120723)；甲醇、乙腈為色譜純；超純水(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水(70∶10∶20)(水用磷酸調(diào)pH至3.0)，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液和供試品溶液的配制

取室溫下減壓干燥至恒重的LM49對(duì)照品和LM49供試品(批號(hào)：20120511)各約5 mg，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得100 mg·L-1的對(duì)照品貯備液和供試品貯備液，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密量取5.0 mL對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋并定容至10 mL，配制成50 mg·L-1的溶液，進(jìn)行DAD檢測(cè)，結(jié)果表明，在261 nm處有最大吸收，確定261 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，LM49的保留時(shí)間為7.48 min，理論板數(shù)按LM49計(jì)算不低于8 000，與相鄰雜質(zhì)的分離度＞1.5，分離良好，峰形對(duì)稱，結(jié)果見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)相關(guān)HPLC色譜圖A-LM49對(duì)照品溶液；B-LM49供試品溶液；C-LM49對(duì)照品/原料/中間體混合溶液；1-LM49；3,4-原料；2-原料中的雜質(zhì)；5,6-中間體Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability of LM49 A-LM49 reference substance; B-LM49 test sample; C-LM49/raw materials/intermediates; 1-LM49; 3,4-raw materials; 2-impurity of raw material; 5,6-intermediates

2.5 線性關(guān)系和方法學(xué)研究

2.5.1 線性關(guān)系 分別精密量取對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋成濃度為1.0，5.0，25，50，75，100 mg·L-1的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以濃度(C)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=37.546C-27.8，r=0.999 9。結(jié)果表明，本品在1.0～100 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 檢測(cè)限及定量限 精密量取對(duì)照品貯備液適量，逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄信噪比(S/N)為3，10的色譜圖。結(jié)果LM49的最低檢測(cè)濃度為0.02 mg·L-1，最低檢測(cè)限為0.4 ng；最低定量濃度為0.05 mg·L-1，最低定量限為1 ng。

2.5.3 精密度 精密量取對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋至濃度為50 mg·L-1的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度，RSD為0.67%；取上述溶液，每天進(jìn)樣1次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度，RSD為1.08%。表明精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性 取同一批供試品(批號(hào)：20120511) 2.5 mg，共5份，精密稱定，置于50 mL量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，按含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果其平均含量為99.26%，RSD為0.51%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性 取濃度為50 mg·L-1(批號(hào)：20120511)的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別測(cè)定其在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h及3 d后的峰面積，以峰面積考察溶液的穩(wěn)定性，RSD為1.46%，結(jié)果表明，室溫放置3 d的供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5.6 回收率 稱取減壓干燥至恒重的同一批供試品(批號(hào)：20120511)5.07 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中。精密量取供試品溶液1.0 mL于10 mL量瓶中，共9份。分別加入對(duì)照品溶液(100 mg·L-1)各0.6，1.0，1.4 mL，各3份，加甲醇稀釋至刻度，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表1。

2.6 含量測(cè)定

取本品3批，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的供試品液，另精密稱取LM49對(duì)照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為100 mg·L-1的對(duì)照品液，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量[2]。結(jié)果批號(hào)為20120302，20120511，20120723的樣品含量分別為100.1%，99.3%，100.4%，RSD分別為0.56%，0.62%，0.44%。

表1 LM49的回收率測(cè)定(n=9)Tab 1 The recovery determination of LM49 (n=9)

2.7 專屬性試驗(yàn)

為考察HPLC的專屬性，根據(jù)合成工藝、化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及貯存條件，對(duì)LM49進(jìn)行了酸、堿、氧化、高溫、強(qiáng)光照射等加速破壞實(shí)驗(yàn)[3-6]。取LM49供試品(批號(hào)：20120511)適量，用甲醇制成100 mg·L-1的溶液，取樣2 mL，共5份。其中1份加2 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸溶液，加熱回流2 h，冷卻至室溫，用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中和至中性；1份加2 mL 0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，加熱回流2 h，冷卻至室溫，用0.1 mol·L-1的鹽酸中和至中性。其中1份加30%過(guò)氧化氫溶液0.5 mL，加熱回流1 h，冷卻至室溫。1份80 ℃加熱回流1 h。另外1份置于4 500 Lx照度下放置72 h。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見圖2。由加速破壞性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，所建HPLC方法能有效檢測(cè)出各破壞性實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，且降解產(chǎn)物均能與主峰達(dá)到良好分離，表明對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查的專屬性良好。

2.8 有關(guān)物質(zhì)的檢查

精密稱取LM49樣品5.0 mg于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為供試溶液，精密量取供試溶液1.0 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照液。精密量取對(duì)照液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的色譜峰高約為滿量程的30%。再精密量取供試溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至對(duì)照品主峰保留時(shí)間的2.5倍。量取供試溶液色譜圖中各雜質(zhì)峰的峰面積總和，用主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量。結(jié)果3批樣品的有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.34%，0.45%和0.48%。

3 討論

LM49易溶于甲醇，因此選用不同配比的甲醇-水組成流動(dòng)相，由于LM49含有酚羥基，呈弱酸性，考察了不同pH值對(duì)化合物色譜行為的影響，最終發(fā)現(xiàn)用磷酸調(diào)節(jié)水相的pH為3.0時(shí)，色譜峰形及分離度均較好，化合物保留時(shí)間適中。流動(dòng)相中加入乙腈，使色譜峰的對(duì)稱性得到了進(jìn)一步優(yōu)化，最終確定流動(dòng)相的配比為甲醇-乙腈-水(70∶10∶20)(水用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)。

本實(shí)驗(yàn)為L(zhǎng)M49建立了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、專屬的HPLC方法，為其質(zhì)量控制及有關(guān)物質(zhì)檢查提供了可靠的依據(jù)。

REFERENCES

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Determination of 2,5’-Dibromo-4,5,2’-trihydroxydiphenylmethanone and Its Related Substances by HPLC

LI Yong, FENG Xiu’e, LIANG Taigang, LI Qingshan*(School of Pharmaceutical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

OBJECTIVE To establish an HPLC method for the determination of 2,5’-dibromo-4,5,2’-trihydroxydiphenylmethanone(LM49) and its related substances. METHODS HPLC method was carried on a column of Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with the mobile phase of methanol-acetonitrile-water (adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid) (70∶10∶20) at the flow rate of 0.8 mL·min-1and the detection wavelength was set at 261 nm. The column temperature was 25 . ℃RESULTS LM49 was completely separated from the impurities. A good linearity(r=0.999 9) of LM49 was obtained at the concentration range of 1.0-100 mg·L-1. The minimal detection limit was 0.02 mg·L-1. The average recovery of method was 99.8%(RSD=0.88%). CONCLUSION The analytical method is simple, rapid, sensitive and accurate for the determination of LM49 and its related substances.

HPLC; 2,5’-dibromo-4,5,2’-trihydroxydiphenylmethanone; related substances; content determination

R917.101

B

1007-7693(2013)10-1104-04

2012-12-21

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA092903)；山西省自然科學(xué)基金(2013011060-2)；山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(01201116)；山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(B03201213)

李勇，男，碩士 Tel: 15903460874 E-mail: yong5130@126.com*

李青山，男，博士，博導(dǎo) Tel: (0351)4690322 E-mail: sxlqs2012@163.com