李 明，劉 霞，郭書翰，董 玫，宋鐵鷹，史清文

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院外一科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院麻醉科，河北

石家莊050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

土木香中倍半萜內(nèi)酯抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖活性的研究

李 明1，劉 霞2，郭書翰2，董 玫2，宋鐵鷹3*，史清文4

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院外一科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院麻醉科，河北

石家莊050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的檢測6種倍半萜內(nèi)酯化合物對人乳腺癌細(xì)胞增殖活性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞KT分別與6種倍半萜內(nèi)酯化合物作用48h，噻唑藍(lán)比色法檢測細(xì)胞存活率；珊塔瑪內(nèi)酯10μmol/L作用MCF-7細(xì)胞24h，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)Bax報告基因和激活T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）報告基因的表達(dá)。結(jié)果異土木香內(nèi)酯和珊塔瑪內(nèi)酯對2種人乳腺癌細(xì)胞均顯示極強(qiáng)的抑制作用，呈劑量依賴性，半數(shù)抑制濃度僅為4.40μmol/L和4.57μmol/L，而其他試驗(yàn)用倍半萜內(nèi)酯即使在100μmol/L高濃度下，對人乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性；珊塔瑪內(nèi)酯可顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞內(nèi)Bax和NFAT報告基因表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論異土木香內(nèi)酯和珊塔瑪內(nèi)酯對2種人乳腺癌細(xì)胞均顯示極強(qiáng)的抑制作用；珊塔瑪內(nèi)酯對人乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的Bax表達(dá)，使NFAT激活，導(dǎo)致線粒體膜的轉(zhuǎn)移滲透孔通透性改變，使細(xì)胞色素C從線粒體釋出，活化caspase 9，進(jìn)而激活caspase 3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生所致。

乳腺腫瘤；細(xì)胞增殖；倍半萜類

土木香系菊科旋覆花屬植物，為多年生草本，性溫，味辛、苦，在我國分布于新疆，其他許多地區(qū)常栽培其根供藥用，具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效。目前已從土木香中分離得到土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯和二氫土木香內(nèi)酯等多種倍半萜內(nèi)酯成分，具有抗腫瘤、抗炎、驅(qū)蟲、抗菌、降血糖和鎮(zhèn)痛等多種生物藥物活性［1-2］。本研究首次報道從土木香根純化的6種倍半萜內(nèi)酯化合物體外抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖活性，并探討倍半萜內(nèi)酯化合物結(jié)構(gòu)與抗腫瘤活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑：6種倍半萜內(nèi)酯化合物異土木香內(nèi)酯（1）、1，5-二乙酰氧基-3，4-環(huán)氧，9-吉瑪烯-12，8-內(nèi)酯（2）、1，5-二乙酰氧基-3，9-吉瑪二烯-12，8-內(nèi)酯（3）、2-羥基-11，13-二氫異土木香內(nèi)酯（4）、11，13-二氫異土木香內(nèi)酯（5）和珊塔瑪內(nèi)酯（6）由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)高效液相色譜法和氫核磁共振波譜法檢查，純度在99％以上（圖1）。噻唑藍(lán)（美國Sigma公司，M-2128）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國，GIBCO）；順鉑（美國Sigma，034k3693）；質(zhì)粒Bax報告基因（pGBax-Luc）、激活T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells）報告基因（NFAT-Luc）和內(nèi)參照基因（SV-40-Rluc）由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一生物化學(xué)教室提供。

1.2 細(xì)胞系：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞KT由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)教室提供。各細(xì)胞接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖1 實(shí)驗(yàn)用6種倍半萜內(nèi)酯化合物的結(jié)構(gòu)①異土木香內(nèi)酯；②1，5-二乙酰氧基-3，4-環(huán)氧，9-吉瑪烯-12，8-內(nèi)酯；③1，5-二乙酰氧基-3，9-吉瑪二烯-12，8-內(nèi)酯；④2-羥基-11，13-二氫異土木香內(nèi)酯；⑤11，13-二氫異土木香內(nèi)酯，⑥珊塔瑪內(nèi)酯Figure 1 Chemical structures of six sesquiterpene lactones for the experiment①Isoalantolactone；②1，5-diacetoxy-3，4-epoxy-9-germacraen-12，8-olide；③1，5-diacetoxy1-11，13-dihydrogen-3，9-germacradien-12，8-olide；④2-hydroxy-11，13-dihydroisoalantolactone；⑤11，13-dihydroisoalantolactone；⑥Santamarine

1.3 噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞生存率：參照文獻(xiàn)［3-4］中的方法，MCF-7和KT細(xì)胞接種于96孔板，每孔含1×104個細(xì)胞，按照分組分別加入終濃度0.1％二甲基亞砜（溶劑對照）、順鉑以及6種倍半萜內(nèi)酯化合物，終濃度為1 000μmol/L，倍比稀釋為11個濃度，每組設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入5g/L的噻唑藍(lán)10μL。實(shí)驗(yàn)終止測定各孔吸光度值（absorbance，A），測定波長λ=570nm，參考波長λ=630nm，計算細(xì)胞存活率，存活率（％）=A給藥組/A對照組×100％。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 7.0軟件進(jìn)行處理，受試藥物對細(xì)胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計算藥物的半數(shù)抑制濃度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 熒光素酶報告基因檢測：參照文獻(xiàn)［5］中的方法，以每孔5×104個MCF-7細(xì)胞接種于24孔板中，用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2次。取500ng熒光素酶基因質(zhì)粒pGBax-Luc和NFAT-Luc以及5ng內(nèi)參照基因質(zhì)粒SV-40-Rluc與1.2g脂質(zhì)體共同加入0.6mL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，混勻室溫孵育30min后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)孔中。于37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。棄去轉(zhuǎn)染液，更換含有終濃度為10μmol/L的順鉑和珊塔瑪內(nèi)酯的10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液1mL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h后，棄去培養(yǎng)液，用融解緩沖液裂解細(xì)胞后，立即上機(jī)檢測，記錄報告基因pGBax-Luc和NFAT-Luc熒光素酶與內(nèi)參照基因SV-40-Rluc熒光素酶活性的比值，以此值表示報告基因的相對表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SAS612統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6種倍半萜內(nèi)酯化合物對人乳腺癌細(xì)胞生存率的影響：100μmol/L的異土木香內(nèi)酯（1）及珊塔瑪內(nèi)酯（6）顯示與陽性對照順鉑相同的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，對MCF-7細(xì)胞生存率分別為7.72％和4.86％，對KT細(xì)胞生存率分別為11.80％和13.03％，與空白對照組比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；其他4種倍半萜內(nèi)酯對2種人乳腺癌細(xì)胞的增殖顯示較弱的抑制活性。

2.2 異土木香內(nèi)酯和珊塔瑪內(nèi)酯對MCF-7細(xì)胞和KT細(xì)胞增殖活性的作用：異土木香內(nèi)酯（1）和珊塔瑪內(nèi)酯（6）對MCF-7細(xì)胞的增殖顯示強(qiáng)于陽性對照順鉑的抑制活性，半數(shù)抑制濃度分別為4.40μmol/L和4.57μmol/L，呈現(xiàn)濃度梯度依賴性；陽性對照順鉑對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移KT細(xì)胞的增殖顯示較弱的抑制活性，化合物1和化合物6對KT細(xì)胞的增殖顯示中等程度的抑制活性，半數(shù)抑制濃度分別為29.78μmol/L和31.52μmol/L。見表1。

表1 異土木香內(nèi)酯和珊塔瑪內(nèi)酯對人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of isoalantolactone and santamarine on the proliferation of breast tumor cells

2.3 珊塔瑪內(nèi)酯對人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)Bax-Luc和 NFAT-Luc基因表達(dá)的影響：用10μmol/L的順鉑和珊塔瑪內(nèi)酯分別處理MCF-7細(xì)胞24h后，檢測順鉑和珊塔瑪內(nèi)酯對MCF-7細(xì)胞內(nèi)報告基因的表達(dá)的影響。與對照組比較，珊塔瑪內(nèi)酯可顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞Bax-Luc和NFAT-Luc的表達(dá)，表達(dá)率分別為空白對照的2.82倍和3.61倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；強(qiáng)于陽性對照順鉑。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，居女性惡性腫瘤的首位［6］。在乳腺癌的治療中，藥物治療占據(jù)非常重要的地位，但臨床上乳腺癌治療藥物的選擇性差，不良反應(yīng)大，一直束縛著其化學(xué)藥物治療的發(fā)展，新開發(fā)的靶向治療藥物，遠(yuǎn)期療效不明確，且治療費(fèi)用不菲，所以開發(fā)常見植物提取物作為抗乳腺癌藥物具有重要的意義和廣闊的發(fā)展前景。

本研究結(jié)果顯示，異土木香內(nèi)酯和珊塔瑪內(nèi)酯對MCF-7細(xì)胞和KT細(xì)胞均顯示極強(qiáng)的抑制作用，強(qiáng)于陽性對照順鉑，為乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療提供了一個新的藥物研究基礎(chǔ)，而其他實(shí)驗(yàn)用倍半萜內(nèi)酯即使在100μmol/L高濃度下，對人乳腺癌細(xì)胞的增殖不顯示出抑制活性。異土木香內(nèi)酯和珊塔瑪內(nèi)酯雖然屬于不同的結(jié)構(gòu)類型，都具有不飽和五元內(nèi)酯環(huán)，而其他的4種倍半萜內(nèi)酯化合物五元內(nèi)酯環(huán)的環(huán)外雙鍵飽和后，對乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞的增殖活性顯著降低或消失，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測：倍半萜內(nèi)酯化合物抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖活性與其直型和角型結(jié)構(gòu)無關(guān)，不飽和五員內(nèi)酯是抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖活性的必需基團(tuán)。具有不飽和五員內(nèi)酯但是A-環(huán)開環(huán)后形成的1，5-二乙酰氧基-3，4-環(huán)氧，9-吉瑪烯-12，8-內(nèi)酯對于人乳腺癌細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性，由此推測A-環(huán)開環(huán)可能是導(dǎo)致桉葉烷型倍半萜內(nèi)酯的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用減弱或消失的原因。

目前臨床應(yīng)用的約1/3抗腫瘤藥物來自植物，其中包括了植物的原形成分和它們的衍生物，如生物堿類、木脂素類及萜類［7-8］。以往的很多醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)均已證明，傳統(tǒng)藥用植物通過很多途徑發(fā)揮作用，如提高機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且許多抗癌藥物可誘導(dǎo)不同類型的敏感腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)利用雙熒光素酶報告基因檢測法，初步研究了珊塔瑪內(nèi)酯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，珊塔瑪內(nèi)酯可明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的Bax表達(dá)，使NFAT激活。NFAT是在高鈣濃度下，經(jīng)鈣調(diào)磷酸化酶催化脫磷酸而被激活的。所以，MCF-7細(xì)胞內(nèi)NFAT的激活反映了細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加。已知，胞內(nèi)高濃度的鈣和促凋亡蛋白Bax，均可導(dǎo)致線粒體膜的轉(zhuǎn)移滲透孔通透性改變，使線粒體中的細(xì)胞色素C釋出，活化caspase 9，進(jìn)而激活caspase 3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，珊塔瑪內(nèi)酯對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，很可能是通過以上的途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡所致。

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［7］ OJIMA I.Modern Natural products chemistry and drug discovery［J］.JMed Chem，2008，51（9）：2587-2588.

［8］ HARVEY AL.Natural products as a screening resource［J］.Curr Opin Chem Biol，2007，11（5）：480-484.

（本文編輯：趙麗潔）

IN VITRO ANTI-HUMAN BREAST TUMOR ACTIVITY OF SIX SESQUITERPENOID LACTONES FROM INULA HELENIUM

LIMing1，LIU Xia2，GUO Shuhan2，DONG Mei2，SONG Tieying3*，SHIQingwen4
（1.Department of Surgery，the First Hospital of Shijiazhuang，Hebei province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department
of Forensic Medicine，HebeiMedical University，the School of Basic Sciences，Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Anesthesiology，the First Hospital of Shijiazhuang，Hebei province，Shijiazhuang 050011，China；4.Department of Medicinal Natural Product Chemistry，the
School of Pharmaceutical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang，050017，China）

Objective To detect the anti-human breast cancer cells effects of six sesquiterpenoid lactones isolated from Inula helenium，and to explore itsmechanism.MethodsThe antihuman breast tumor effects of six sesquiterpenoid lactones were investigated using human breast cancer cell（s MCF-7 and KT）.The cell viabilities were examined by MTT assay.MCF-7 cells were transiently cotransfected by pGBax-Luc and NFAT-Luc reporter plasmid and SV-40-Rluc plasmid.The effects of santamarine of luciferase activity expression were detected by dual-luciferase reporter assays.ResultsIsoalantolactone and santamarine exhibited significantly anti-growth activities to human breast cancer，andhalfmaximal inhibitory concentration value of MCF-7 and KT cell were 4.40μmol/L and 4.57μmol/L exposure.Other sesquiterpenoid lactones demonstrated weak anti-growth activities to cell lines even in the concentration ofmore than 100μmol/L.The reporter gene of pGBax-Luc and NFAT-Luc were observed in response to santamarine.ConclusionIsoalantolactone and santamarine have significant anti-growth activities in human breast cancer cells.The possiblemechanism of the anti-human breast tumor activity of santamarine is through caspase-3 and caspase-9 activation inducing cell apoptosis.

breast neoplasms；cell proliferation；sesquiterpenes

R737.9

A

1007-3205（2013）08-0869-04

2013-02-21；

2013-03-26

國家自然科學(xué)基金（81072551）；河北省衛(wèi)生廳指導(dǎo)性課題（20110550）；河北省科技支撐計劃項(xiàng)目（11276103D-89）

李明（1979-），男，河北平山人，河北省石家莊市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事腺體惡性腫瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail：song84989@aliyan.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.001