王春偉 許允成 高 潔 王 燕

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

甲霜靈即N－(2－甲氧基乙?；?－N－(2，6－二甲苯基)－D，L－丙氨，屬酰胺類殺菌劑，高效低毒、殘效期長，具有很強的保護和治療作用［1］，屬于特異性位點抑制劑［2］，作用機制是通過抑制卵菌綱真菌的蛋白質(zhì)合成而起作用。甲霜靈能透過種皮，隨著種子的萌發(fā)和生長，可內(nèi)吸傳導到植株的根莖葉，并隨植物體內(nèi)水分運轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)移到植物的各器官，可以做莖葉處理、種子處理和土壤處理。可有效防治霜霉病菌、疫霉病菌和腐病菌引起的多種作物霜霉病，瓜果蔬菜類的疫霉病、谷子白發(fā)病、煙草黑脛病、大豆根腐病、花生根腐病、棉花猝倒病、水稻爛秧病和向日葵霜霉?。?］。最近幾年甲霜靈作為防治苗期根部病害和疫病的藥劑在人參上得到了廣泛應用［4］。

目前，國外對中藥材中農(nóng)藥殘留日益重視，并制定了嚴格的農(nóng)藥殘留限量標準，農(nóng)殘問題已成為我國人參出口的主要障礙［5］。甲霜靈的檢測方法主要有氣相色譜法［6］、高效液相色譜法［7－8］、氣質(zhì)聯(lián)用［9－11］、液質(zhì)聯(lián)用［12］等，其在水果、蔬菜上的殘留檢測方法和殘留限量有報道［8－11］，但在人參上的殘留檢測方法和殘留限量未見報道。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)是以質(zhì)譜儀為檢測手段，集高效液相色譜(HPLC)高分離能力與質(zhì)譜(MS)高靈敏度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有靈敏度高、廣譜性強、抗干擾好等優(yōu)點。為此，本試驗采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術研究了甲霜靈在人參和土壤中的檢測方法并制定了最大殘留限量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1110 高效液相色譜儀(ChemStantion 工作站，美國安捷倫公司)，色譜柱為Kromasil Eternity－5－C18，2.1 mm×150 mm;API 4000 液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Applied Biosystems 公司);組織搗碎機(20 000 r/min);T18 ULTRA－TURRAX 勻漿機(德國IKA 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SA31(瑞士Büchi 公司);Mettler PL1500－s 電子天平(0.01 g);彩色單道移液槍(1、5、10 mL)(德國Eppendorf 有限公司);固相萃取柱:迪馬公司ProElut GPR 固相萃取柱(1.5 g，12 mL);渦漩混勻器;離心機:10 000 r/min;醫(yī)用注射器，0.22 μm 濾膜等。

甲苯為色譜純;丙酮、乙腈、甲酸均為優(yōu)級純(GR);水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水;甲霜靈標準品純度為98.0%，由國家標準物質(zhì)信息中心提供;35%甲霜靈拌種劑由浙江禾本農(nóng)藥化學有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 消解動態(tài)試驗

人參上的消解動態(tài)試驗為土壤拌土處理，一次施藥，多次采樣。施藥劑量為5 250 g/hm2(推薦劑量的1.5 倍)，小區(qū)面積為15 m2，3 次重復。分別在施藥后的采樣間隔為0(在施藥后藥液基本風干的2 h 之內(nèi))、7、14、21、28、35 d 采樣。土壤采樣每小區(qū)按對角線取5 點，深度為0 ～10 cm，四分法留樣2.0 kg;人參五點法取樣，樣品為1.0 kg。同期采集空白樣品，標簽標記后于－20 ℃條件下保存待測［13］。

1.2.2 最終殘留試驗

設2 個處理分別為3 500 g/hm2和5 250 g/hm2，設空白小區(qū)，每處理設3 次重復。在施藥后的14、21、35 d 和人參收獲期采集人參樣品，同期采集空白樣品，采樣方法同1.2.1。－20 ℃條件下保存待測。

1.2.3 樣品前處理方法

提取方法:稱?。?0 ℃冷凍保存的鮮人參、土壤樣品各100 g，依次用搗碎機將樣品粉碎;取1 g 樣品于50 mL 離心管中，加入丙酮20 mL，用渦漩混勻器混合1 min 后以8 000 r/min 離心5 min;取上清液，再向離心管中加入20 mL 丙酮，重復提取1 次;合并上清液于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5 mLV(乙腈)∶V(甲苯)=3 ∶1 乙腈—甲苯溶解，待凈化。

固相萃取凈化(SPE):10 mL V(乙腈)∶V(甲苯)= 3 ∶1 預淋洗GPR 固相萃取柱，流出液棄去。將5 mL 溶解液傾入GPR 固相萃取柱中，用20 mL V(乙腈)∶V(甲苯)=3 ∶1 進行洗脫。收集全部洗脫液于雞心瓶中，于35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。用乙腈溶解，并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后供LC－MS/MS 測定。

1.2.4 檢測方法

色譜柱柱溫度:40 ℃;流動相為V(甲酸水)∶V(乙腈)= 1 ∶9，其中甲酸水為V(甲酸)∶V(水)=1 ∶999;流速250 μL/min;離子源溫度為725 ℃;進樣量10 μL;正離子掃描，多反應監(jiān)測(MRM);電離方式為電噴霧(ESI)，電噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力為0.483 MPa;氣簾氣壓力為0.138 MPa，輔助加熱氣壓力為0.379 MPa。甲霜靈的質(zhì)譜檢測條件見表1。

表1 甲霜靈的ESI－MS 的質(zhì)譜檢測條件

1.2.5 定性測定

利用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測器進行定性分析，在上述條件下，甲霜靈的出峰時間為4.13 min。甲霜靈標準品(質(zhì)量濃度為0.01 μg/g)的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1。

圖1 甲霜靈液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖

在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對豐度與質(zhì)量濃度接近，且與同樣條件下的標準溶液譜圖相比，最大允許相對偏差不超過表2中的規(guī)定范圍。

表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許相對偏差

1.2.6 標準曲線的建立

分別準確稱取甲霜靈標準品10 mg(精確至0.1 mg)，置于100.0 mL 容量瓶中，用丙酮溶解，并定容至刻度配制成質(zhì)量濃度100 mg/L 的標準儲備液，用移液管準確移取標準貯備溶液，根據(jù)需要用空白基質(zhì)液定容配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L 5 個系列標準溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標建立標準曲線。

1.2.7 方法的準確度、精密度試驗

準確稱取空白對照區(qū)的1 g 土壤、1 g 人參空白試樣，分別添加適量甲霜靈標準溶液，使添加質(zhì)量分數(shù)分別為0.01、0.02、0.2 μg/g，按1.2.3 所述方法進行測定，每個添加試驗設定10 個平行和1 個對照，計算添加回收率、變異系數(shù)和相對標準偏差。

1.2.8 方法的穩(wěn)定性試驗

準確稱取不同基質(zhì)的空白樣品各1.0 g，分別添加適量甲霜靈標準溶液，使其質(zhì)量分數(shù)為0.02 μg/g，5 h 后按1.2.3 所述方法進行測定，每個添加試驗設定10 個平行和1 個對照，計算添加回收率、變異系數(shù)和相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

甲霜靈在0.01 ～0.5 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與響應值有良好的線性關系，標準曲線見圖2，線性方程為Y=30 300X+247 000，相關系數(shù)為0.999 3。

圖2 甲霜靈的標準曲線

2.2 方法的準確度、精密度、最低檢出限

方法的準確度用添加回收率來表示，精密度用相對標準偏差來表示。

對10 個近似空白的樣本進行測定，得出響應值標準差，按最小檢出限為空白值3 倍標準差計算，將峰面積換算成被測物質(zhì)量分數(shù)，甲霜靈的最小檢出限為0.01 μg/g。

取空白人參和土壤試樣1.0 g，分別添加0.01、0.02、0.20 μg/g 3 個水平，甲霜靈在人參和土壤中的平均添加回收率分別為88.70% ～90.40%，86.56 ～92.70%，變異系數(shù)分別為6.60% ～8.51%，4.80% ～6.24%，符合殘留試驗要求，結(jié)果見表3。

表3 甲霜靈在人參及土壤中的添加回收率

2.3 方法的穩(wěn)定性

當添加0.02 μg/g，5 h 后測定，甲霜靈在人參和土壤中的平均添加回收率分別為86.50%，83.50%，變異系數(shù)分別為6.70%，8.95%，見表3。通過對比2.2 試驗結(jié)果，回收率、變異系數(shù)和相對標準偏差變化很小，表明本方法具有很好的穩(wěn)定性。

表3 甲霜靈在人參及土壤中的添加回收率

2.4 消解動態(tài)試驗

通過2011年在吉林省撫松縣的田間試驗研究了甲霜靈在人參和土壤中的降解動態(tài)。從表4可知:甲霜靈在人參根和土壤中降解動態(tài)符合一級反應動力學方程Ct=C0e－Kt。其中:Ct為施藥后間隔時間t 時農(nóng)藥質(zhì)量分數(shù);C0為施藥后的原始沉積量;K為降解速率常數(shù);t 為施藥后的時間。由此可求出降解半衰期t1/2=ln2·K－1。試驗結(jié)果經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換與回歸分析，在5 250 g/hm2處理劑量下，甲霜靈在人參根和土壤中半衰期分別為15.04、6.67 d，屬于易降解農(nóng)藥(t1/2＜30 d)。

2.5 最終殘留試驗

試驗結(jié)果表明:施用35%甲霜靈拌種劑，3 500 g/hm2劑量下人參和土壤中的殘留量分別為0.009、0.004 8 μg/g;5 250 g/hm2劑量下人參和土壤中的殘留量分別為0.017、0.010 4 μg/g，見表5。

表4 甲霜靈在人參根和土壤中的消解動態(tài)

表5 甲霜靈在人參和土壤中的最終殘留

3 結(jié)束語

建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測甲霜靈在人參及土壤中的殘留方法。研究結(jié)果表明，甲霜靈在人參和土壤中的平均添加回收率分別為88.70% ～90.40%和86.56 ～92.70%，變異系數(shù)分別為6.60% ～8.51%和4.80% ～6.24%。該方法測定人參及土壤中的甲霜靈殘留，操作簡單，定性、定量準確，精密度高，重現(xiàn)性好，檢出限低，能滿足生產(chǎn)上對甲霜靈檢測限量的要求。

試驗結(jié)果表明:按5 250 g/hm2劑量施藥，甲霜靈在人參和土壤中的降解半衰期分別為15.04 d 和6.67 d，甲霜靈在土壤中的消解率明顯快于人參，可能是因為土壤中微生物降解的作用。我國尚未制定甲霜靈在人參中最大殘留限量標準，而韓國規(guī)定甲霜靈在紅人參中最大殘留限量為2 μg/g，在干人參中最大殘留限量為0.5 μg/g，日本制訂的人參殘留限量標準為0.05 μg/g，歐盟制訂的人參殘留限量標準0.1 μg/g［14］。因此，參照以上殘留限量規(guī)定及田間試驗殘留動態(tài)數(shù)據(jù)，35%甲霜靈拌種劑在施藥劑量為3 500 ～5 250 g/hm2時，施藥1 次，建議人參根中最大殘留限量值為0.05 μg/g，人參的安全間隔期為14 d。

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