苗志加，薛桂松，翁冬晨，曹貴華，彭永臻

（北京工業(yè)大學(xué) 北京市水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100124）

強(qiáng)化生物除磷技術(shù)（Enhanced Biological Phosphorus Removal，簡稱EBPR）已成為生物除磷的重要途徑，日益受到學(xué)者們的關(guān)注。EBPR是以富集的聚磷菌（PAOs）在厭氧條件下吸收VFA用于細(xì)胞內(nèi)合成PHA并且釋放磷，好氧條件下分解PHA提供能量同時(shí)過量吸磷，通過排泥達(dá)到除磷的目的［1］。EBPR的設(shè)計(jì)大多是以ASM2號(hào)模型為基礎(chǔ)，PAOs衰減速率作為模型中最重要的參數(shù)之一，獲得其準(zhǔn)確的數(shù)值對(duì)建立完善、實(shí)用的數(shù)學(xué)模型具有重要意義，同時(shí)對(duì)EBPR生物處理過程的設(shè)計(jì)和運(yùn)行管理、控制策略也具有借鑒意義［2－4］。水溫的變化對(duì)于微生物衰減速率有重要的影響［5］，在實(shí)際污水處理廠運(yùn)行過程中主要面臨的問題也是季節(jié)溫差變化較大，尤其是中國北方大部分地區(qū)水溫波動(dòng)較大。目前對(duì)于EBPR系統(tǒng)衰減特征的研究主要是環(huán)境溫度恒定在20℃左右，Lu等［6］采用PAOs純度達(dá)到85%的EBPR系統(tǒng)為研究對(duì)象，考察了22℃條件下PAOs在厭氧、缺氧、好氧的衰減過程，Hao等［7］考察了同樣是恒定環(huán)境溫度在22±0.5℃的條件下PAOs和聚糖菌（GAOs）好氧條件下的衰減特征，而目前對(duì)于低溫下PAOs的衰減特征的研究未見報(bào)道。所以本文采用已運(yùn)行340d的EBPR系統(tǒng)內(nèi)種泥，考察不同溫度對(duì)PAOs在厭氧和好氧條件下的衰減特性，并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段鑒定分析細(xì)胞死亡引起的數(shù)量衰減所占比例［8］。

1 材料與方法

1.1 衰減速率試驗(yàn)裝置及運(yùn)行方式

衰減速率試驗(yàn)在3L抽濾瓶中進(jìn)行，取已富集PAOs濃度達(dá)到90%以上的EBPR系統(tǒng)內(nèi)好氧結(jié)束時(shí)刻的種泥，持續(xù)曝氣5h后平均分裝在4個(gè)小試反應(yīng)器內(nèi)，加入不含碳源的配水定容為2L，采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，其轉(zhuǎn)速為100r·min－1。1＃，2＃反應(yīng)器放置在10℃恒溫培養(yǎng)箱，3＃、4＃放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱。1＃、3＃為厭氧條件，試驗(yàn)過程中曝氮?dú)庖员ＷC厭氧環(huán)境。2＃、4＃為好氧條件，控制空氣流量為0.1m3／h保證溶解氧在2.0以上。

4個(gè)反應(yīng)器分別在第0、0.5、1、3、5、7、9d取250mL泥水混合物，6 000轉(zhuǎn)離心5min，用配水清洗2遍離心后放入500mL錐形瓶中，加入0.127 5g乙酸鈉（200mgCOD），配水補(bǔ)足500mL，厭氧攪拌1h，測(cè)定期間的磷釋放速率。在運(yùn)行的9d內(nèi)每天取泥樣，測(cè)污泥濃度、PHA、糖原的變化。

1.2 試驗(yàn)水質(zhì)

配水配方如下［9］：NH4Cl 1.02g·L－1，MgSO4·7H2O1.20g·L－1，CaCl2·2H2O 0.19g·L－1，ATU（硝化抑制劑）7.94mg·L－1，微量元素溶液4ml·L－1，其中微量金屬元素成分為：FeCl3·6H2O 1.5g·L－1，H3BO30.15g·L－1，CuSO4·5H2O 0.03g·L－1，KI 0.18g·L－1，MnCl2·4H2O0.12g·L－1，Na2MoO4·2H2O 0.06g·L－1，ZnSO4·7H2O 0.12g·L－1，CoCl2·6H2O 0.15g·L－1，乙二胺四乙酸（EDTA）10g·L－1。4個(gè)反應(yīng)器內(nèi)加入Tris－buffer使系統(tǒng)維持pH值穩(wěn)定在7.5左右。

1.3 試驗(yàn)種泥

試驗(yàn)種泥采用已乙酸／丙酸交替運(yùn)行340d的EBPR系統(tǒng)內(nèi)污泥，通過熒光原位雜交（FISH）結(jié)果分析，其PAOs的純度高達(dá)90%±2，污泥齡（SRT）：10d。

1.4 LIVE／DEAD活死細(xì)胞鑒定

1.4.1 常規(guī)檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)所用常規(guī)檢測(cè)方法見水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第4版）［10］。PHA及其組分采用氣相色譜法［11］；VFA采用氣相色譜法。

1.4.2 LIVE／DEAD活死細(xì)胞鑒定 采用LIVE／DEADRBacLightTM（moleculer probes，L－7012）試劑盒測(cè)定第0、0.5、1、3、5、7、9d的泥樣中活死細(xì)胞的變化情況。該試劑包括綠熒光核酸染料SYTOR9和紅色熒光染料PI（propidium iodide）2中熒光染料，與待測(cè)樣品孕育一定時(shí)間后，具有完整細(xì)胞壁的活細(xì)胞顯綠色，細(xì)胞壁已經(jīng)破損的的死細(xì)胞顯紅色。

染色步驟對(duì)試劑盒的方法進(jìn)行了優(yōu)化，每次取待測(cè)泥樣15mL，去離子水清洗1遍后離心后倒去上清液，采用0.85%的NaCl浸泡1h，期間隔10min上下顛倒一次。取1mL經(jīng)預(yù)處理的泥樣與2mL離心管內(nèi)，分別加入0.5μL的SYTOR9和0.5μL的PI染料，混合均勻后在暗處放置15min，期間上下混勻2～3次。取10μL已染色的泥樣制作玻片，在熒光顯微鏡下觀測(cè)拍照30組照片。同一視野內(nèi)照紅綠兩組熒光照片，通過AxioVision軟件對(duì)照片做灰度分析并結(jié)合IPP軟件的計(jì)數(shù)分析，得出綠色和紅色熒光所占的比例，即活死細(xì)胞所占的比例。

1.5 衰減速率的計(jì)算

對(duì)0、0.5、1、3、5、7、9d的磷釋放速率的對(duì)數(shù)值做線性回歸分析，計(jì)算公式如下：R0為未衰減初始時(shí)刻磷釋放速率，Rt為衰減后某一時(shí)刻磷釋放速率，td為衰減時(shí)間［12］。細(xì)胞活性衰減通過對(duì)0、0.5、1、3、5、7、9d死細(xì)胞比例進(jìn)行回歸線性計(jì)算，得到其衰減數(shù)值［6］。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同溫度對(duì)PAOs厭氧好氧衰減速率的影響

圖1為4個(gè)反應(yīng)器在不同溫度下厭氧衰減和好氧衰減過程中磷釋放速率的變化?？梢钥闯鲈谒p開始后的1d內(nèi)4個(gè)系統(tǒng)其活性沒有下降反而都略有上升，在其后的8d里活性平緩下降，此實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象未見報(bào)道。分析可能的原因是本研究所用種泥中含有少量顆?；勰?，在衰減初始的第1d內(nèi)這部分顆?；勰嘧匀埽粌H提供了少量碳源基質(zhì)也使顆粒內(nèi)PAOs溶出，使得系統(tǒng)中PAOs的相對(duì)活性增加；也有可能是種泥細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)的能源底物還沒有完全消耗掉，第1d內(nèi)并沒有造成實(shí)際意義上的衰減。

圖1 不同溫度條件下PAOs的衰減速率變化

設(shè)定第1d為初始R0，對(duì)1～9d內(nèi)4個(gè)系統(tǒng)釋磷速率的對(duì)數(shù)值做線性回歸，結(jié)果如圖2所示，得到期間10℃厭氧、10℃好氧、20℃厭氧、20℃好氧對(duì)應(yīng)PAOs的平均衰減速率分別為：0.053、0.050、0.072、0.145／d。HAO等［6］在22℃±2的好氧條件下，測(cè)得7d內(nèi)PAOs的平均衰減速率為0.113／d，與本試驗(yàn)結(jié)果比較，這個(gè)數(shù)值低于本試驗(yàn)中20℃好氧所得衰減速率，這可能是由于他們所用種泥的SRT為12d，略高于本實(shí)驗(yàn)中的10d，長SRT條件下運(yùn)行的系統(tǒng)可能會(huì)培養(yǎng)出更耐饑餓的菌種［13］。由圖1可以看出從第5d開始20℃條件下的2個(gè)系統(tǒng)衰減速率開始迅速下降，通過式（1）計(jì)算，5～9d內(nèi)20℃厭氧、20℃好氧對(duì)應(yīng)PAOs的平均衰減速率分別為：0.081、0.199／d，見表1。而在此期間10℃條件下衰減速率并無明顯變化且好氧與厭氧衰減速率具有相似的數(shù)值。由此可以看出不同溫度對(duì)PAOs在厭氧和好氧的衰減代謝有重要影響，溫度越高衰減速率越快。低溫條件（10℃）下好氧衰減速率與厭氧衰減速率差別不大，常溫（20℃）條件下好氧衰減速率大于厭氧衰減速率。

圖2 不同條件衰減過程中衰減速率對(duì)數(shù)值的變化

2.2 不同溫度下PAOs厭氧好氧細(xì)胞活性鑒定

在污水生物處理過程中，微生物的衰減包括細(xì)胞的死亡和功能性微生物活性的喪失，然而在大多數(shù)學(xué)模型和文獻(xiàn)報(bào)道中，細(xì)胞衰減被單一的認(rèn)為是細(xì)胞死亡引起的數(shù)量衰減，對(duì)于細(xì)胞活性衰減并沒有特意區(qū)分［3，14］，試驗(yàn)研究中利用 LIVE／DEAD 試劑盒鑒定0～9d內(nèi)死活細(xì)胞數(shù)量的變化，通過軟件分析得到活細(xì)胞所占比例，結(jié)果如圖3所示。通過線性回歸分析得出，PAOs在不同溫度好氧與厭氧條件下的衰減速率。

由圖3可知，溫度對(duì)微生物生理代謝有直接的影響，溫度越高微生物代謝活性越快，同時(shí)在饑餓衰減的條件下，污泥中有一部分細(xì)胞會(huì)發(fā)生自溶并產(chǎn)生少量外源底物［15］，PAOs可以利用這一部分底物合成細(xì)胞內(nèi)貯存底物，維持活性或二次生長。溫度越高細(xì)胞自溶數(shù)量越多，細(xì)胞死亡所占衰減速率的比例越低，計(jì)算結(jié)果見表1。在不同溫度厭氧條件下的2個(gè)系統(tǒng)細(xì)胞活性衰減速率一致，都為0.019／d，不同溫度好氧條件下PAOs細(xì)胞活性衰減速率數(shù)值對(duì)比比較明顯，10℃與20℃的溫度下其數(shù)值分別為：0.017、0.30／d。由此可得出好氧條件下PAOs的細(xì)胞活性衰減隨溫度升高而加快，但是厭氧條件下10℃與20℃沒有變化。通過計(jì)算可得10℃厭氧、10℃好氧、20℃厭氧、20℃好氧4個(gè)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞死亡所占的衰減比例分別為：35.8%、34%、26.4%、20.7%。

圖3 不同條件衰減過程中活細(xì)胞所占比例變化

表1 不同條件下PAOs的衰減速率

2.3 不同溫度下PAOs內(nèi)碳源代謝變化

聚羥基烷酸（PHA）和糖原作為PAOs細(xì)胞內(nèi)貯存的能源物質(zhì)，在饑餓狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞的衰減起著重要的作用，圖4、圖5顯示4個(gè)系統(tǒng)PHA與糖原的變化情況。由圖4可知，1＃（10℃厭氧）與3＃（20℃厭氧）系統(tǒng)PHA濃度在第0～2d的變化趨勢(shì)相似，均迅速降低；10℃條件下第7d出現(xiàn)的最小值：1.094mg PHA／g VSS，20℃條件下第2d出現(xiàn)最小值：1.24mg PHA／g VSS，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的最低PHA含量與Temmink等［16］在低碳源負(fù)荷下得到1.55mg PHA／g VSS的數(shù)值接近。1＃（10℃厭氧）系統(tǒng)2～9d內(nèi)維持在最小值略有波動(dòng)，而3＃（20℃厭氧）系統(tǒng)在2～9d里其數(shù)值不下降反而升高，在第6d達(dá)到了9.778mg PHA／g VSS，分析原因可能是在與10℃相比20℃厭氧衰減過程中，細(xì)胞自溶的量更大，給PAOs提供了外碳源從而合成細(xì)胞內(nèi)的PHA。而Lopez等［17］的研究結(jié)果表明，在20±2℃下PAOs厭氧衰減過程中PHA含量在第1d就達(dá)到最小值：5.2mg PHA／g VSS，7d內(nèi)并無明顯變化，這與1＃系統(tǒng)內(nèi)變化趨勢(shì)相似，而與3＃系統(tǒng)差異較大。這可能與污泥性質(zhì)與馴化過程不同有關(guān)，本試驗(yàn)采用乙酸／丙酸交替運(yùn)行，已富集到純度達(dá)90%±2聚磷菌，而Lopez采用乙酸為單一碳源富集的PAOs純度較低，菌群結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。

好氧條件下，2＃與4＃系統(tǒng)在起始衰減階段由于PHA可以被氧化提供能量，在0.5d內(nèi)其含量便迅速降低，如圖4所示。10℃條件下衰減，PAOs中PHA含量略高于20℃條件下的數(shù)值，其1～9d的平均值 分 別 為：1.97mg PHA／g VSS，0.43mg PHA／g VSS。

圖4 不同條件衰減過程中PHA變化情況的

圖5 不同條件衰減過程中糖原變化情況

衰減過程中糖原的變化如圖5所示。在0～1d不同溫度條件下，厭氧衰減過程中糖原濃度降低，好氧衰減過程中糖原濃度升高，4個(gè)反應(yīng)器內(nèi)糖原的變化符合典型的PAOs代謝模型［18］：厭氧條件下糖原被分解為丙酮酸同時(shí)供還原力生成PHA，濃度下降；好氧條件下一部分PHA重新轉(zhuǎn)化為糖原，濃度升高。Lu等［6］研究結(jié)果表明，PAOs在20±2℃下厭氧衰減，在0～2d內(nèi)細(xì)胞生長代謝所需的ATP由糖原與聚磷顆粒一起提供，而在2～8d期間主要是聚磷顆粒產(chǎn)生ATP，糖原濃度浮動(dòng)較小。然而本實(shí)驗(yàn)在1～9d期間，4個(gè)系統(tǒng)內(nèi)糖原濃度均呈下降趨勢(shì)，且下降幅度較大，這與Lu等研究結(jié)果差異較大。分析原因可能是，種泥起始狀態(tài)中所含糖原濃度不同，本實(shí)驗(yàn)所用種泥中糖原濃度含量更高，在饑餓條件下糖原作為能源物質(zhì)分解用來提供細(xì)胞代謝的能量。在整個(gè)衰減試驗(yàn)過程中：同樣溫度下，糖原的厭氧降解速率大于好氧降解速率；在厭氧、好氧的衰減過程中，溫度越高糖原降解速率越快。

3 結(jié) 論

1）考察了在10、20℃條件下PAOs厭氧、好氧衰減速率，結(jié)果表明溫度越高衰減速率越明顯。在初始階段由于種泥中一部分顆粒污泥破碎，4個(gè)系統(tǒng)在衰減1d后釋磷活性反而升高，在1～9d里釋磷速率逐漸下降，其平均值分別為：1＃（10℃厭氧）：0.053／d；2＃（10℃好氧）：0.050／d；3＃（20℃厭氧）：0.072／d；4＃（20℃好氧）：0.145／d。

2）通過LIVE／DEAD試劑盒鑒定0～9d衰減期內(nèi)細(xì)胞的活性，測(cè)得4個(gè)衰減系統(tǒng)內(nèi)由細(xì)胞死亡所引起衰減速率為：10℃厭氧：0.019／d；10℃好氧：0.017／d；20℃厭氧：0.019／d；20℃好氧：0.03／d，溫度越高細(xì)胞死亡引起的活性衰減占總活性衰減比例越低，其比例分別為：35.8%、34%、26.4%、20.7%。

3）在10、20℃溫度條件下的厭氧、好氧衰減的4個(gè)系統(tǒng)中，細(xì)胞內(nèi)所貯存的PHA與糖原被分解用來提供能量，在9d衰減過程中其濃度總體均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。相同溫度下，糖原在厭氧衰減過程中降解速率大于好氧；在同樣的厭氧、好氧衰減條件下，溫度越高糖原降解速率越快。

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