馮志剛，徐名烤，修寧寧，歐日花，劉肖瑛，李忠信

(東莞康華醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞523080)

同型半胱氨酸對(duì)腺苷脫氨酶試劑交叉污染的分析

馮志剛，徐名烤，修寧寧，歐日花，劉肖瑛，李忠信

(東莞康華醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞523080)

目的探討篩查和確認(rèn)交叉污染來(lái)源的思路，評(píng)估對(duì)應(yīng)消除措施的效果。方法發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)后緊跟腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測(cè)存在交叉污染，通過(guò)用兩個(gè)可比的生化檢測(cè)系統(tǒng)配對(duì)分析一組20例患者標(biāo)本和5例質(zhì)控樣本ADA結(jié)果來(lái)篩查交叉污染，分析試劑空白數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線數(shù)據(jù)辨別其來(lái)源，然后分別采用加強(qiáng)清洗、特殊清洗和調(diào)整檢測(cè)順序來(lái)消除交叉污染并確認(rèn)其效果。結(jié)果兩組患者標(biāo)本ADA差值為7.20±3.20U/L，質(zhì)控樣本差值為6.00±1.73 U/L，P＜0.05存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。交叉污染發(fā)生前后，ADA檢測(cè)反應(yīng)曲線加入試劑R2后第22點(diǎn)吸光度分別為0.01094±0.00129和0.03544±0.00605，提示ADA試劑R2被污染。將HCY調(diào)整至ADA之后檢測(cè)，試劑空白吸光度回復(fù)正常，措施有效。結(jié)論合理設(shè)置生化項(xiàng)目檢測(cè)順序能夠有效地避免試劑交叉污染的發(fā)生。

交叉污染；腺苷脫氨酶；同型半胱氨酸

目前各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室已廣泛引進(jìn)國(guó)內(nèi)外不同品牌和類(lèi)型的全自動(dòng)生化分析儀，其快速、高效、準(zhǔn)確、精密的特點(diǎn)，極大地提高了生化檢測(cè)的質(zhì)量和效率。其中潛在的交叉污染也是一種不可忽視的現(xiàn)象，防范措施除常用的沖洗之外尚有特氟隆涂層技術(shù)、空氣分隔、惰性液分隔、清洗設(shè)置、超聲混勻、超聲洗滌和項(xiàng)目間隔等方式[1]。有關(guān)交叉污染的發(fā)生已有較多報(bào)道[2-5]，但目前尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方案來(lái)對(duì)其進(jìn)行篩查和確認(rèn)[6]。本文報(bào)道發(fā)生在同型半胱氨酸(HCY)試劑與腺苷脫氨酶(ADA)試劑之間的交叉污染，在影響單一的檢測(cè)結(jié)果外，更嚴(yán)重的是導(dǎo)致ADA試劑穩(wěn)定性不為所知的緩慢變化，藉此提供一種發(fā)現(xiàn)并解決此類(lèi)問(wèn)題的思路和做法。

1 材料與方法

1.1 儀器SIEMENS ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀。SIEMENS DADE RXL全自動(dòng)生化分析儀。試劑：浙江寧波美康生物科技有限公司HCY試劑盒(循環(huán)酶法，浙食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2009第2400443號(hào))和ADA試劑盒(酶比色法，浙食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第2400646號(hào))。校準(zhǔn)品、質(zhì)控品：浙江寧波美康生物科技有限公司提供HCY、ADA配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。標(biāo)本：2012年10月期間，選取我院住院患者次日空腹，門(mén)診患者和健康體檢人群當(dāng)日，真空采集靜脈血4ml，30min內(nèi)離心分離血清，上機(jī)檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 交叉污染的發(fā)現(xiàn)在SIEMENS ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定HCY，CKMB，ADA三個(gè)項(xiàng)目順序檢測(cè)，因故取消CKMB后出現(xiàn)ADA項(xiàng)目質(zhì)控偏移和患者結(jié)果無(wú)法解釋的升高現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用同廠試劑和校準(zhǔn)品在SIEMENSDADEDimension RXL生化分析儀上檢測(cè)相同質(zhì)控和患者標(biāo)本，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析結(jié)果。

1.2.2 交叉污染來(lái)源的篩查全自動(dòng)生化分析儀的交叉污染可能由樣本針、攪拌棒、比色杯、試劑針攜帶產(chǎn)生。從上述現(xiàn)象初步懷疑是試劑針交叉污染。收集并分析交叉污染發(fā)生前后ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)做篩查。

1.2.3 交叉污染的確認(rèn)選取出現(xiàn)交叉污染前200例及交叉污染后20例患者標(biāo)本ADA檢測(cè)情況進(jìn)行研究，根據(jù)SIEMENS ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀提供的反應(yīng)曲線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，整理分析加入試劑1+樣本、加入試劑2后兩個(gè)讀數(shù)點(diǎn)吸光度范圍，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，找出引起試劑交叉污染的組分。查看試劑說(shuō)明書(shū)，分析可能造成交叉污染的組分。

1.2.4 交叉污染的消除和確認(rèn)分別使用如下三種方法避免交叉污染，并觀察試劑空白吸光度數(shù)據(jù)的變化來(lái)確認(rèn)其有效性。(1)應(yīng)用ADVIA2400儀器的防污染沖洗功能，設(shè)置ADA試劑R1、R2加樣前后使用去離子水清洗水加強(qiáng)沖洗；(2)設(shè)置ADA試劑R1、R2加樣前后使用Reagent Probe 2特殊清洗；(3)將HCY的檢測(cè)順序調(diào)整至ADA之后。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件，患者標(biāo)本和質(zhì)控樣本ADA結(jié)果使用配對(duì)t檢驗(yàn)。交叉污染發(fā)生前后吸光度數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

2 結(jié)果

2.1 SIEMENS ADVIA 2400和SIEMENS DADE Dimension RXL分別對(duì)一組患者標(biāo)本和質(zhì)控樣本進(jìn)行檢測(cè)的配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)ADVIA組患者標(biāo)本及質(zhì)控樣本均高于Dimension組，存在明顯的交叉污染。

表1 ADVIA 2400與Dimension RXL患者標(biāo)本和質(zhì)控樣本的配對(duì)t檢驗(yàn)

2.2 交叉污染發(fā)生前后試劑空白數(shù)據(jù)對(duì)比見(jiàn)表2?？梢钥闯鍪艿轿廴镜腁DA試劑在第7d超出廠商說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的有效范圍0.2，無(wú)法繼續(xù)使用。

2.3 分析ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀的ADA反應(yīng)曲線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，交叉污染發(fā)生后的測(cè)試過(guò)程中加入試劑1和樣本后第7點(diǎn)吸光度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而加入試劑2后第22點(diǎn)吸光度明顯高于交叉污染發(fā)生前，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表3)，提示交叉污染可能來(lái)源于試劑2。

表3 交叉污染發(fā)生前后反應(yīng)曲線第7點(diǎn)、第22點(diǎn)吸光度比較

表3 交叉污染發(fā)生前后反應(yīng)曲線第7點(diǎn)、第22點(diǎn)吸光度比較

注：*表示P＜0.05，交叉污染前后加入試劑2后第22點(diǎn)吸光度存在顯著性差異。

加入試劑2后第22點(diǎn)交叉污染前交叉污染后組別n加入試劑1和樣本后第7點(diǎn)200 20 0.01267±0.00099 0.01204±0.00101 0.01094±0.00129 0.03544±0.00605*

查詢(xún)廠商說(shuō)明書(shū)，HCY和ADA試劑組分見(jiàn)表4?？梢钥闯鯤CY試劑2成分中含有濃度高達(dá)5KU/L的腺苷脫氨酶，通過(guò)試劑2針對(duì)ADA試劑R2產(chǎn)生交叉污染，除造成患者標(biāo)本和質(zhì)控樣本結(jié)果偏高外，還引起ADA試劑空白逐漸升高，導(dǎo)致廠商聲稱(chēng)的一個(gè)月開(kāi)蓋穩(wěn)定期縮短為不到一周。

表4 HCY、ADA試劑盒試劑組分

2.4 將交叉污染發(fā)生前、發(fā)生后、加強(qiáng)清洗、特殊清洗和調(diào)整檢測(cè)順序等條件下的ADA試劑每日空白吸光度數(shù)據(jù)繪制圖1。從圖中可以看出加強(qiáng)清洗、特殊清洗不能消除HCY對(duì)ADA的試劑交叉污染，將HCY調(diào)整至ADA檢測(cè)之后可以達(dá)到預(yù)期效果。圖中還可明顯看出，HCY、CKMB、ADA的檢測(cè)順序條件下比HCY調(diào)整至ADA之后相比，ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)高，可見(jiàn)間隔一個(gè)CKMB項(xiàng)目不能完全杜絕HCY對(duì)ADA的交叉污染。

3 討論

現(xiàn)在全自動(dòng)生化分析儀發(fā)展迅猛，不斷涌現(xiàn)的新方法和新項(xiàng)目，更快的檢測(cè)速度，不斷增長(zhǎng)的試劑倉(cāng)容量，包含離子選擇電極、酶電極、比色法，比濁法等多種檢測(cè)單元，甚至整合有標(biāo)記技術(shù)原理的免疫模塊，這些先進(jìn)的技術(shù)促進(jìn)了儀器檢測(cè)水平的提高，同時(shí)在實(shí)際工作中也帶來(lái)了一些新的挑戰(zhàn)和復(fù)雜的情況，交叉污染就是其中一個(gè)始終值得我們高度重視的問(wèn)題。而試劑由于其項(xiàng)目種類(lèi)繁多，成分復(fù)雜，儲(chǔ)存及使用條件嚴(yán)格，反應(yīng)中所需要的量遠(yuǎn)大于樣本量，因此容易發(fā)生交叉污染，且隱蔽性強(qiáng)，難于發(fā)現(xiàn)[7，8]，從而成為臨床實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)管理的重要內(nèi)容[9]。

表2 交叉污染發(fā)生前后ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)

圖1 ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)隨時(shí)間的變化

本文中由于HCY試劑2中含有高達(dá)5KU/L濃度的ADA，通過(guò)試劑2針交叉污染造成單一測(cè)試結(jié)果升高和ADA試劑穩(wěn)定性明顯下降，通過(guò)加強(qiáng)清洗，特殊清洗等措施均無(wú)法徹底解決，只能將HCY調(diào)整至ADA之后，由此還發(fā)現(xiàn)問(wèn)題未暴露出來(lái)之前兩者中間隔一個(gè)項(xiàng)目CKMB，實(shí)際上也存在一定程度的交叉污染。一般來(lái)講，試劑間造成交叉污染有如下原因：(1)一種試劑中含有另一個(gè)項(xiàng)目的目標(biāo)分析物；(2)一種試劑中含有另一種試劑的成分；(3)一種試劑的某種成分作為另一種試劑反應(yīng)時(shí)的中間產(chǎn)物，參與反應(yīng)；(4)一種試劑與標(biāo)本產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物與另一種試劑與標(biāo)本發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物相類(lèi)似；(5)一種試劑的酸堿度對(duì)另一種試劑的酸堿度產(chǎn)生大的影響從而對(duì)反應(yīng)有干擾。一些可能發(fā)生交叉污染的情況在很多全自動(dòng)生化分析儀已由廠商預(yù)先設(shè)定或?yàn)闄z驗(yàn)工作者廣泛應(yīng)用：(1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(IFCC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(IFCC)試劑中含有高活力乳酸脫氫酶,可能會(huì)對(duì)血清乳酸脫氫酶的測(cè)定帶來(lái)干擾；堿性磷酸酶( IFCC)、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、二氧化碳(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)等多種試劑中含有鎂離子，可能會(huì)對(duì)血清鎂測(cè)定帶來(lái)干擾；膽堿酯酶(碘化丁酰硫代膽堿)、膽固醇、葡萄糖(氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)等試劑使用磷酸緩沖液，可能會(huì)對(duì)無(wú)機(jī)磷的測(cè)定帶來(lái)干擾；甘油經(jīng)常用作試劑中酶的保護(hù)劑，因此這些試劑可能影響甘油三酯的測(cè)定。(2)肌酸激酶、肌酸激酶同工酶試劑中含有葡萄糖成分,其檢測(cè)步驟中包含葡萄糖己糖激酶(HK)反應(yīng)過(guò)程,因此可能對(duì)葡萄糖尤其對(duì)己糖激酶法測(cè)定帶來(lái)嚴(yán)重干擾。(3)鎂離子測(cè)定試劑(Calmagite)中含有EGTA成分,為Ca2+絡(luò)合劑,可能對(duì)Ca2+的測(cè)定帶來(lái)干擾。(4)基于過(guò)氧化物工具酶Trinder反應(yīng)系統(tǒng)的項(xiàng)目不能排列在一起[10]。

目前，對(duì)于交叉污染尚無(wú)完整、標(biāo)準(zhǔn)的方案可供應(yīng)用。CLSI推出的指南EP10-A2“Preliminary Evaluation of Quantitative Clinical Laboratory Methods”文件中采用低中高3個(gè)濃度的樣本以特定的順序重復(fù)檢測(cè)3批，計(jì)算樣本間交叉污染率。林蓮英等[11]研究表明這個(gè)方案簡(jiǎn)便結(jié)果可靠，適于實(shí)際工作中使用。本文從利用患者樣本和質(zhì)控在兩個(gè)可比的檢測(cè)系統(tǒng)上結(jié)果的差別，試劑空白的變化，實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線的吸光度數(shù)據(jù)等方面來(lái)進(jìn)行交叉污染的篩查和來(lái)源識(shí)別，采取相應(yīng)的消除措施后再對(duì)其有效性加以確認(rèn)，提供了一種具有針對(duì)性分析的思路。

臨床工作中應(yīng)該從以下幾個(gè)方面防范試劑交叉污染的發(fā)生。當(dāng)生化分析儀清洗能力下降或者內(nèi)部存在大量殘留污垢時(shí)，常規(guī)清洗無(wú)法有效地消除交叉污染，所以應(yīng)該規(guī)范地執(zhí)行儀器的維護(hù)保養(yǎng)，定期校準(zhǔn)儀器的性能。新項(xiàng)目或者新試劑引入設(shè)置的時(shí)候[12]，要參照說(shuō)明書(shū)中的反應(yīng)原理、試劑組成成分、保存和使用條件，合理編排檢測(cè)順序，避免交叉污染，減少項(xiàng)目的時(shí)候也要注意類(lèi)似的問(wèn)題[13]。實(shí)際工作中同一標(biāo)本內(nèi)的檢測(cè)順序可以按照優(yōu)化的設(shè)定執(zhí)行，還要注意標(biāo)本間項(xiàng)目的銜接、急診標(biāo)本的插入、試劑用空導(dǎo)致檢測(cè)順序的改變等各種少見(jiàn)情況[14]。此外，對(duì)于全自動(dòng)免疫分析儀的項(xiàng)目例如乙肝表面抗原和乙肝表面抗體，乙肝e抗原和乙肝e抗體檢測(cè)之間也可能存在試劑交叉污染，因此檢驗(yàn)工作者應(yīng)該全面深刻地認(rèn)識(shí)交叉污染的危害，熟悉儀器項(xiàng)目性能，善于應(yīng)用發(fā)散思維，預(yù)先采用各種防范措施，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

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Assay of reagent carryover of homocysteine to adenosine deaminase

FENG Zhigang,XU Mingkao,XIU Ningning,et al.Department of Clinical Laboratory,Dongguan Kanghua Hospital,Guangdong Dongguan 523080,China

Objective To investigate the method of screening and confirming carryover and to assess the effect of corresponding means to eliminate it.Methods Carryover took place when ADA was analysed after HCY in clinical chemistry automatic analyzer.ADA concentrations in serum of 20 patients and 5 control materials were measured on two set of clinical chemistry systems to screen carryover.Reagent blank data and reaction curve monitor data were checked to find out the source of carrywer.Extra rinse,special rinse and arrangement of assays order were used to eliminate reagent carryover and the effects were observed.Results Differences of ADA concentration in patients were 7.20±3.20U/L and 6.00±1.73 U/L for those of control materials,showing statistical signification as P＜0.05.With occurrence of ADA reagent 2 carryover,the absorbance data at the 22nd point of ADA reaction monitor curve were 0.03544±0.00605 against normal 0.01094±0.00129.When HCY was set after ADA,data of reagent blank of ADA recur normal.Conclusion Proper arrangement order of clinical chemistry assays can avoid reagent carryover.

Carryover;Adenosine deaminase;Homocysteine

R446.11+2

A

1674-1129(2013)03-226-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.009

馮志剛,1978年7月出生，男，漢族，山西省寧武縣人，碩士，主管技師，主要研究方向?yàn)榕R床生化和分子生物學(xué).