顏 洪，張 瓊，吳 丹，宋華培 (第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所，創(chuàng)傷燒傷復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400038)

能量代謝障礙是缺氧導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損害的根本原因，因此缺氧條件下，細(xì)胞及時有效地啟動內(nèi)源性能量保護(hù)機(jī)制對保護(hù)細(xì)胞功能，提高細(xì)胞抗缺氧能力至關(guān)重要。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為細(xì)胞能量狀態(tài)的感受器和調(diào)節(jié)器在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)性反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色［1］。AMPK屬于一組進(jìn)化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，由一個催化亞基(α)和兩個調(diào)節(jié)亞基(β和γ)3個亞單位組成［2］。AMPKα亞基Thr172位點(diǎn)被其上游激酶(AMPKK)磷酸化是AMPK充分活化的主要標(biāo)志和必要條件。本研究擬利用基因重組技術(shù)構(gòu)建His-AMPKα312截短缺失融合蛋白，將其作為AMPK磷酸化激活的檢測底物，為深入研究各種病理生理?xiàng)l件對AMPK活化的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞;Tripure isolation reagent(TIR);Trizol RNA;ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit(TOYOBO);DNA Marker DL2000(TaKara);Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas);DNA回收試劑盒(TIANGEN);質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen);AMPK-αpan抗體，磷酸化 AMPK-α抗體(Upstate);PCR 儀(ABI PCR System 2700);高速低溫離心機(jī)(Beckman);凝膠成像分析系統(tǒng)(BioRad)。Anti-His Antibody購自天根生化科技(北京)有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)及二硫蘇糖醇(DDT)購自BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)檢測 AMPKα1基因擴(kuò)增:取新生Wistar大鼠心室肌，0.125%胰蛋白酶消化分離，置入含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，利用差速貼壁法除去非心肌細(xì)胞并加入5-溴脫氧尿嘧啶0.11 mmol/L以抑制非心肌細(xì)胞增殖。培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總 RNA，以其為模板，按 ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit試劑盒說明書操作，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得1 011 bp的prkaa1(即AMPKα1基因)大片段基因。引物是根據(jù)prkaa1大片段基因序列自行設(shè)計(jì)，引物序列見表1。反應(yīng)條件為:94℃變性5 min，然后開始PCR循環(huán):94℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，共35個循環(huán)，72℃延長10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 引物序列

目的基因的克隆:①prkaa1-936目的基因片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增prkaa1-936目的基因的引物是根據(jù)prkaa1-936基因序列自行設(shè)計(jì)，并在片段末端加有終止密碼子，片段左右兩端分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列見表1。擴(kuò)增片段大小為936 bp。反應(yīng)條件為:94℃變性5 min，然后開始PCR循環(huán):94℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，共35個循環(huán)，72℃延長10 min，4℃保存。DNA電泳觀察鑒定。②擴(kuò)增所得片段連接T載體并測序。切膠，用回收試劑盒回收擴(kuò)增片斷。并連接 T-vector，回收產(chǎn)物 4.5 μl，T-vector 0.5 μl，Solution Ⅰ 5 μl，4 ℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5αE.coli，涂 LB(Kan 抗性)平板，37℃過夜。挑取單個菌落，接于3 mL LB(Kan抗性)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜。用小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切和BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖電泳檢測，所提質(zhì)粒正確。編號YH2。

重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將YH2質(zhì)粒和PET28a(+)分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，分別回收酶切片斷，反應(yīng)體系:YH2回收產(chǎn)物 4.5 μl，PET28a(+)回收產(chǎn)物 0.5 μl，Solution I 5 μl，4℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5αE.coli，涂LB(Kan抗性)平板，37℃過夜。挑取單個菌落，接于3 mL LB(Kan抗性)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜。用小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切和BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖電泳檢測，所提質(zhì)粒正確。編號YH2/PET28a(+)。

目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測:取100 μl YH2/PET28a(+)菌液接于4 mL LB(Kan抗性)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8，加入IPTG 誘導(dǎo)3 h，分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液作SDS-PAGE檢驗(yàn)。

1.2.2 AMPKα1312蛋白純化 將構(gòu)建成功的 prkaa1 表達(dá)菌株200 μl接種 LB 培養(yǎng)基800 mL，37 ℃，250 r/min離心，過夜培養(yǎng)，加誘導(dǎo)劑IPTG至濃度1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。5 000 r/min離心15 min，離心收集菌體，15 mL PBS緩沖液重懸菌體，于冰浴超聲破碎菌體后，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀。取上一步驟收集的沉淀，分別用2、4、8 mol/L尿素溶解，12 000 r/min離心15 min，取其上清制備電泳樣品。另外，第一步的菌液(記為大樣)和第二步的上清(記為上清)也分別制備電泳樣品。電泳樣品行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將沉淀用3 mL 8 mol/L尿素溶解后，過鎳瓊脂糖凝膠柱，50 mmol/L咪唑溶液洗滌，300 mmol/L咪唑溶液洗脫并收集純化蛋白prkaa1，行10%SDS-PAGE檢測蛋白純度。

1.2.3 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化的重組蛋白行10%SDS-PAGE后，采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)印至 PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h。以AMPK-pan α抗體(1∶1 500稀釋)，37℃ 孵育2 h。以HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶10 000稀釋)為二抗，孵育1 h。洗膜后于凝膠成像儀顯影。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得

在prkaa1大片段基因RT-PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上調(diào)取prkaa1-936目的片段。DNA電泳觀察鑒定:取10 μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用DL2000 Marker作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)帶，溴乙錠染色，紫外透射儀上觀察并照相。結(jié)果見936 bp出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶(圖1)，與所需目的基因大小吻合。

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定及基因測序分析

將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體PET28a(+)分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5αE.coli。挑取單個菌落，用小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化分別回收酶切片斷，分別用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切和BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖電泳檢測，所提質(zhì)粒正確(圖2)。陽性克隆送Invitrogen生物技術(shù)有限公司(上海)測序，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增的prkaa1基因序列完全正確，與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄序列完全一致，并準(zhǔn)確插入表達(dá)載體。將該重組質(zhì)粒命名為YH2/PET28a(+)。

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建成功的prkaa1表達(dá)菌株通過搖菌、破菌。取100 μl YH2/PET28a(+)菌液接于4 mL LB(Kan抗性)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8，加入IPTG誘導(dǎo)3 h，收集的沉淀，分別用2、4、8 mol/L尿素溶解做SDS-PAGE檢測。結(jié)果見prkaa1是以包含體形式表達(dá)，并且大部分溶解于8 mol/L尿素(圖3a)。將沉淀用3 mL 8 mol/L尿素溶解后，過鎳瓊脂糖凝膠柱，50 mmol/L咪唑溶液洗滌，300 mmol/L咪唑溶液洗脫并收集純化蛋白prkaa1，行10%SDS-PAGE檢測蛋白純度，結(jié)果顯示如圖3b。

2.4 重組蛋白的 Western blot鑒定

Western blot分析顯示，純化的重組蛋白可與兔抗大鼠AMPK-αpan抗體特異結(jié)合，在相對分子質(zhì)量約38 kD處可見明顯反應(yīng)條帶，見圖4。表明純化的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

3 討論

圖1 prkaa1-936 PCR產(chǎn)物電泳

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 His-AMPKα1312截短缺失融合蛋白的表達(dá)與純化

圖4 AMPKα1312純化蛋白的Western blot檢測

近年來的研究證明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為細(xì)胞能量中心感受器和效應(yīng)器在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和缺氧適應(yīng)性反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色。當(dāng)各種營養(yǎng)或環(huán)境應(yīng)激如:運(yùn)動［3］，饑餓［4］，氧化應(yīng)激［5］，以及缺血缺氧［6］等應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP下降，細(xì)胞能荷降低時(即ATP∶AMP比值降低)，AMPK即被 AMP變構(gòu)激活。除了被AMP變構(gòu)激活外，AMPK還可被其上游激酶 AMPKK 磷酸化激活［7］，AMPKK 使 AMPKα 亞基Thr172位點(diǎn)磷酸化從而導(dǎo)致AMPK顯著激活(超過50倍)，該激活程度顯著高于AMP變構(gòu)激活［8］。更重要的是，AMPK也可被一種或多種上游激酶(AMPKK)磷酸化激活，其關(guān)鍵的磷酸化位點(diǎn)是位于α亞基激活環(huán)中的Thr172殘基，該位點(diǎn)的磷酸化對于AMPK活化是必須的，如果該位點(diǎn)缺失或沒有被磷酸化則AMPK將不具有任何可檢測的活性［9-10］。

截短的AMPKα1312雖然不能再與β和γ亞基結(jié)合形成異三聚體，但其不僅含有AMPK的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)，同時也保留了大部分的激酶活性，是深入研究不同病理生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)AMPK以及其上游激酶AMPKK活性的重要手段。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化了具有生物活性的 AMPKα1312蛋白，本實(shí)驗(yàn)中獲得的重組AMPKα1312截短缺失蛋白主要以包含體形式存在，需要進(jìn)行蛋白復(fù)性，我們利用梯度稀釋透析的方法使包含體蛋白重新折疊復(fù)性，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明，其保持了較好的生物活性。本實(shí)驗(yàn)采用的是相對小分子質(zhì)量的His作為標(biāo)簽，便于 Ni-NTA柱親和層析純化，對重組蛋白的空間構(gòu)象和蛋白活性影響相對較小，不需要后期酶切，實(shí)驗(yàn)操作更加簡單、方便。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析表明，該蛋白為大鼠AMPKα1截短缺失融合蛋白反應(yīng)原性正確。深入研究各種病理生理?xiàng)l件對AMPK活化的影響奠定基礎(chǔ)。

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