石淙，張長林，簡正偉，江梅，聞芳，萬臘根

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

·論著·

體外定點突變PCR法構(gòu)建abl T315I突變的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

石淙，張長林，簡正偉，江梅，聞芳，萬臘根

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

目的利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定點突變技術(shù)構(gòu)建含人類abl基因第6號外顯子片段的野生型及含T315I突變型重組質(zhì)粒，作為檢測abl T315I基因突變的陽性對照和陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品。方法先設(shè)計包括突變位點的兩對引物，以健康人外周血基因組DNA為模板，擴增獲得野生型和突變型abl基因第6號外顯子片段，將其插入pSG5M-flag載體質(zhì)粒中，并將所獲重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切與測序鑒定，通過紫外分光光度計檢測標(biāo)本的濃度和純度。結(jié)果DNA測序表明在預(yù)期位點上發(fā)生突變，abl基因第315位氨基酸密碼子由蘇氨酸(Thr)殘基突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)殘基，所構(gòu)建abl基因野生型和突變型質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定與目的片段完全一致。結(jié)論PCR技術(shù)誘導(dǎo)定點突變準(zhǔn)確、高效。所構(gòu)建含野生型和T315I突變的abl基因重組質(zhì)粒，可為檢測abl基因T315I突變提供陰性和陽性對照以及質(zhì)控品，同時也為T315I突變的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

定點突變；abl基因；T315I；陽性對照

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)屬造血干細(xì)胞克隆性血液腫瘤，主要累及粒細(xì)胞系，90%以上患者可檢測到特異性Ph染色體及bcr/abl融合基因。Ph染色體是9號染色體長臂和22號染色體長臂易位的結(jié)果，使得9q34的abl原癌基因斷裂并易位到22q11的斷裂點集簇區(qū)(BCR)，并在斷點處重新組合形成BCR/ABL融合基因。研究顯示，bcr/abl融合基因及其突變在CML發(fā)生與預(yù)后中起著重要的作用。T315I點突變時，abl基因第6號外顯子的第315位蘇氨酸(Thr)被異亮氨酸(Ile)替代，堿基由ACT變?yōu)锳TT。迄今為止，該點突變是CML患者最難以克服且預(yù)后最差的類型。因此，檢測abl T315I突變有助于判斷CML療效與預(yù)后。目前常用的檢測abl基因突變的方法為等位基因特異性PCR法(AS-PCR)，為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。因此獲得此突變的基因片段的重組質(zhì)粒作為陽性對照和陰性對照非常重要，而采用普通的PCR方法難以獲得T315I突變的abl cDNA片段。本研究采用體外定點突變的方法，從健康人基因組中通過PCR獲得突變的abl cDNA片段，并構(gòu)建野生型和突變型abl基因重組質(zhì)粒，作為后續(xù)檢測的標(biāo)準(zhǔn)品和對照。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株工程菌E.coli DH5α、pSG5M-

Flag質(zhì)粒載體均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、PstⅠ和T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；瓊脂糖購自GENE TECH公司；2×Taq Master Mix購自康為世紀(jì)公司；PCR引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成；瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒、DNA Marker、普通質(zhì)粒小提試劑盒均購自TIANGEN公司。

1.1.3 主要器材超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)，電子天平(上海賽多利斯天平有限公司)，熱循環(huán)擴增儀(ABI2720)，電泳儀、電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)，高速離心機(中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)，HZ-9211K恒溫振蕩器(太倉市科教器材廠)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計按照引物設(shè)計原則，采用引物定點突變的方法[2]，根據(jù)GenBank中正常abl基因序列設(shè)計3條引物，野生型下游引物(A1)，突變型下游引物(A3)，以及共同的上游引物(A2)。其中A1和A3引入EcoRⅠ酶切位點，且A3中帶有一個突變位點，即在第6號外顯子第315位密碼子的點突變(ACT→ATT)；A2引入PstⅠ酶切位點。3條引物分別是：A1：5＇-atcGAATTCgttcccgtaggtcatg-3＇(內(nèi)含EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點)；A3：5＇-atc-GAATTCgttcccgtaggtcatgaactcaatgatgat-3＇(內(nèi)含EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點，同時引入突變位點) A2：5＇-ccCTGCAGaaattcaagttcactggc-3＇(內(nèi)含PstⅠ限制性內(nèi)切酶位點)。劃線部分為酶切位點，方框內(nèi)為突變堿基。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，用高壓滅菌水配制成10μmol/L。

1.2.2 目的基因的擴增分別執(zhí)行下列2個反應(yīng)，反應(yīng)體系均為50μl，依次加入25μl 2×Taq Master Mix；2μl引物A1(另一反應(yīng)體系為A3)；2μl引物A2；5μl健康人淋巴細(xì)胞基因組為模板；16μl高壓滅菌水。反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物A1/A2擴增的產(chǎn)物命名為wild；引物A3/A2擴增的產(chǎn)物命名為T315I。

1.2.3 野生型和T315I突變的abl重組質(zhì)粒的構(gòu)建將擴增得到的野生型和突變型abl基因片段以及pSG5M-flag質(zhì)粒載體通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ均經(jīng)37℃雙酶切過夜，基因片段酶切反應(yīng)體系為50μl，2μl EcoRⅠ，2μl PstⅠ，30μl abl基因片段，5μl 10×H buffer，11μl滅菌水。載體質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系為50μl，2μl EcoRⅠ，2μl PstⅠ，15μl載體質(zhì)粒pSG5M-flag，5μl 10×H buffer，26μl滅菌水。次日，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)割膠回收后，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。連接反應(yīng)體系為10μl，4μl野生型/突變型基因片段酶切產(chǎn)物，1μl載體質(zhì)粒pSG5M-flag酶切產(chǎn)物，5μl T4DNA連接酶。次日，將10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，接種至含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜振蕩。用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計定量測定后進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.4 野生型和T315I突變的abl重組質(zhì)粒的酶切和測序鑒定取4μl提取好的重組質(zhì)粒pSG5M-flag-abl(wild)和pSG5M-flag-abl(T315I)，通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，酶切條件為：10× H buffer 1μl，EcoRⅠ和PstⅠ各0.5μl，重組質(zhì)粒4μl，加滅菌水至10μl，放置37℃水浴中酶切4h后，加入10×Loading Buffer進(jìn)行電泳分離，同時將未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒作為陰性對照，然后在紫外光下鑒定條帶，當(dāng)重組質(zhì)粒中含有目的片段時，酶切將產(chǎn)生兩條帶。將酶切成功的質(zhì)粒送公司測序，然后與GenBank中的序列進(jìn)行比對。

1.2.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度和純度檢測先采用EB緩沖液或者三蒸水在紫外分光光度儀波長260 nm/ 280nm處做空白校正，然后取2μl重組質(zhì)粒pSG5M-flag-abl(wild)和pSG5M-flag-abl(T315I)，用EB或者三蒸水稀釋至50μl，采用紫外分光光度儀測定標(biāo)準(zhǔn)品OD260和OD280，每個標(biāo)本重復(fù)檢測3次，并通過OD260/OD280的比值評估標(biāo)準(zhǔn)品的純度。

2 結(jié)果

2.1 野生型和含T315I突變的abl基因片段的獲取通過PCR定點突變方法從正常人基因組中擴增而獲得野生型和突變型abl基因第6號外顯子片段，片段長度均為281bp，如圖1A所示。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定含野生型abl基因片段的pSG5M-flag-abl(wild)和含T315I突變基因片段的pSG5M-flag-abl(T315I)經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶

切后，進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，如圖1B所示。酶切后的野生型和突變型重組質(zhì)粒在5000bp和300bp左右的位置出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果符合(理論上兩質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)的兩條帶分別為4800bp和281bp)。

2.3 重組質(zhì)粒測序鑒定野生型和突變型重組質(zhì)粒中插入的片段僅相差一個堿基，將酶切正確的重組質(zhì)粒送生工測序，判斷插入的片段是否正確。結(jié)果顯示：野生型pSG5M-flag-abl(wild)重組質(zhì)粒中abl的DNA序列與GenBank中公布的序列一致；含T315I突變的pSG5M-flag-abl(T315I)重組質(zhì)粒中abl的DNA中有一個突變位點，為C突變?yōu)門，如圖2所示，其余均無突變或移碼，與預(yù)期設(shè)計一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)濃度的測定采用紫外分光光度儀檢測到陰性對照pSG5M-flag-abl(wild)和陽性對照pSG5M-flag-abl(T315I)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為148.3g/ml和125.7g/ml，通過計算得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度分別為2.97×1013copies/ml和2.51× 1013copies/ml，其OD260/OD280值分別為1.746和1.820(見表1)。

3 討論

圖1 目的片段PCR擴增及重組質(zhì)粒酶鑒定電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

表1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和純度檢測

abl基因位于9q34.1，基因全長170kb左右，由11個外顯子組成。abl基因mRNA長5388bp，其開放式閱讀框全長為3392bp。它易位到22q11的bcr區(qū)形成bcr/abl融合基因。該基因可轉(zhuǎn)錄出一個8.5kb的異常mRNA，最終翻譯成相對分子質(zhì)量為210kD的蛋白質(zhì)(P210)。P210具有較強的酪氨酸蛋白激酶活性，可通過多種信號傳導(dǎo)途徑來活化癌基因和某些細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

臨床上用于治療CML的一線藥物是甲磺酸伊馬替尼(IM)，它作為第一代信號傳導(dǎo)抑制劑，能與bcr/abl融合蛋白ATP結(jié)合位點結(jié)合，競爭性結(jié)合abl酪氨酸激酶催化部位的ATP與胸苷激酶(TK)受體的結(jié)合位點，阻滯TK磷酸化，從而抑制信號傳導(dǎo)，使酪氨酸激酶不能與ATP結(jié)合，失去催化活性。隨著病程發(fā)展，幾乎所有CML急變期和近15%～20%CML經(jīng)IM長期治療后復(fù)發(fā)的患者對IM產(chǎn)生了耐藥，究其原因為bcr/abl融合基因發(fā)生了點突變，阻礙了與IM的結(jié)合。因此，對于IM耐藥的CML患者，可選擇第二代信號傳導(dǎo)抑制劑達(dá)沙替尼(Dasatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)和博舒替尼

(Bosutinib)等，但三者均對bcr/ablT315I突變型無效[3]，在已發(fā)現(xiàn)的100多種bcr/abl點突變中[4,5]，T315I突變頻率約占15%左右[5]。

目前檢測T315I點突變的方法很多[6-8]，以ASPCR靈敏度高，特異性好，但該方法容易污染，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此在檢測中需設(shè)陽性對照和陰性對照及空白對照。本研究通過體外定點突變PCR方法構(gòu)建了野生型和突變型abl重組質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度均在1013copies/ml以上，可作為abl基因T315I突變檢測的陽性和陰性對照以及質(zhì)控品。

由于從患者血液內(nèi)所提取的DNA中存在大量正常abl基因的干擾，此時普通PCR不能區(qū)分野生型和突變型abl基因。因此，要獲得純突變的abl基因片段較困難，需做大量的篩選工作，消耗大量的人力、物力和時間。由于PCR時引物和模板退火時相對特異，當(dāng)引物3’末端3～4個堿基與模板不匹配時，在較低的退火溫度時PCR也可擴增下去。本研究設(shè)計一條含39個堿基的突變型下游引物，巧妙地將目的堿基突變，使得引物3’端第8個堿基由G→A，其它堿基與abl基因完全匹配，然后以正常人外周血DNA為模板，在較低退火溫度下擴增abl基因片段，這樣擴增得到的片段均含有突變位點，再將其插入到載體質(zhì)粒中，即可用作為檢測該基因突變的陽性對照和質(zhì)控品，也為abl T315I基因突變的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]徐芬,張長林,簡正偉,等.采用定點突變PCR構(gòu)建c-kit D816V突變的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2012,30(2):123-125.

[2]Weisberg E,Manley PW,Cowan-Jacob SW,et al.Second generation inhibitors of BCR-ABL for the treatment of imatinib-resistant chronic myeloid leukaemia[J].Nat Rev Cancer,2007,7(5):.345-356.

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Construction of plasmid standard preparations for abl T315I mutation detection by PCR-based site-directed mutagenesis in vitro

SHI Cong，ZHANG Zhanglin，JIAN Zhengwei，et al.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

ObjectiveTo construct the recombinant plasmids containing the 6th exon fragment of wild-type abl and T315I mutant abl gene as the negative and positive control to detect T315I mutation in abl gene using the site-directed mutagenesis PCR. Methods Two pairs of primers were designed according to the gene sequence of abl,and mismatches were introduced into primers. The genomic DNA of healthy human peripheral blood serves as template.The wild type exon 6 fragment and the T315I mutant of abl were amplified by PCR.Then the PCR products were inserted into pSG5M-Flag plasmid and the recombinant plasmids were identified by enzyme digestion and DNA sequencing.The purity and concentration of plasmids were estimated by ultraviolet spectrophotometer.Results The sequencing analysis showed that the mutation site was correct.The 315th amino acid codon of abl gene mutated to Ile from Thr,indicating successful construction of mutant abl gene.Conclusion The data suggest that thePCR site-directed method has high accuracy and efficiency.Recombinant plasmids containing wild type exon 6 and the T315I mutant of abl were constructed successfully,which could serve as the negative and positive controls when we detect the T315I mutation of abl gene in further study.

Site-directed mutagenesis；abl gene；T315I；Positive control

R733.72,Q343.1+3

A

1674-1129(2013)02-0111-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.003

江西省自然科學(xué)基金(201221AB205025)

石淙，碩士，主攻血液學(xué)診斷。

萬臘根，教授，碩士生導(dǎo)師。