陳 昕，趙 雷，周余來

腎臟疾病在臨床具有較高的發(fā)病率，近些年來，隨著相關(guān)醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，許多疾病得到了有效控制，但是，腎衰竭等腎臟疾病尚未得到有效治療，相關(guān)的死亡率也沒有得到明顯的改善，部分慢性疾病常反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，其發(fā)病率甚至有逐年增高的趨勢［1，2］。

目前，部分研究表明，腎小管細(xì)胞的損傷，是多種腎疾病的最終促成因素［3－5］。因此，本實驗旨在優(yōu)化大鼠腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為腎臟疾病的體外研究提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級 Wistar大鼠，雌性，體重80－110 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物許可證號：SCXK－（吉）2007－0003。

1.2 試劑及儀器 DMEM／F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司，II型膠原酶購自Sigma公司，Percoll分離液購自Pharmacia公司，兔抗大鼠CK－18 IgG單克隆抗體購自北京博鰲森生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC－羊抗兔IgG多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，羊抗兔IgG SABC試劑盒及濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CCK－8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。IX－70倒置相差顯微鏡及正置生物學(xué)顯微鏡均購自日本Olympus公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 大鼠腎小管上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 斷頸處死大鼠，用75%酒精進(jìn)行全身消毒，開腹取出腎臟，去除腎包膜后，棄去髓質(zhì)，剪碎皮質(zhì)后，用PBS反復(fù)沖洗，洗凈殘余血液成分。用0.1%的Ⅱ型膠原酶，于37℃震蕩消化20 min，收集消化液，并用適量PBS溶液洗滌殘余組織塊2次，收集清洗液，消化液和清洗液經(jīng)80目篩網(wǎng)過濾后，1 800 rpm離心5 min收集沉淀。沉淀經(jīng)PBS清洗2－3次后，用DMEM／F12培養(yǎng)基懸起，用45%Percoll分離液進(jìn)行梯度分離，3 000 rpm離心20 min，進(jìn)一步分離純化腎小管節(jié)段［6］。將腎小管節(jié)段接種在培養(yǎng)皿內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下，對腎小管節(jié)段進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，2－3天換液一次。

1.4 大鼠腎小管上皮細(xì)胞的觀察和鑒定 在腎小管節(jié)段貼壁后，于倒置相差顯微鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞的生長狀態(tài)，記其生長特征；待腎小管上皮細(xì)胞從腎小管組織周圍爬出后，對細(xì)胞進(jìn)行CK－18的免疫組化染色，免疫組化染色過程按SABC和DAB試劑盒操作說明進(jìn)行，染色結(jié)果于正置生物學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察；同時，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CK－18的表達(dá)情況。

1.5 維生素C對大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖活力的影響 將腎小管上皮細(xì)胞以1×103cells／well的量種于96孔板中，每孔終體積為100μl，用含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別在接種后的第0天、第1天和第2天，用CCK－8方法檢測細(xì)胞的增殖情況，具體操作方法按CCK－8試劑盒操作說明進(jìn)行。用此方法對P2、P3代細(xì)胞的增殖活力進(jìn)行初步分析，并檢測在加入不同劑量（10 mg／L、30 mg／L和100 mg／L）維生素C后，P3代細(xì)胞的增殖變化情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)觀察和鑒定結(jié)果

大鼠腎小管節(jié)段在貼壁12 h后，可見小管節(jié)段形狀明顯改變，培養(yǎng)24 h后，上皮細(xì)胞開始從組織內(nèi)爬出，細(xì)胞呈鋪路石樣生長（圖1）。細(xì)胞在培養(yǎng)一周左右可進(jìn)行首次傳代。

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：用本實驗方法分離的腎小管上皮細(xì)胞，CK－18的表達(dá)效率在90%以上，腎小管上皮細(xì)胞具備一定的純度（圖2）。免疫組化染色結(jié)果顯示：腎小管上皮細(xì)胞的CK18表達(dá)呈陽性，陽性率在90%以上，且CK－18主要集中在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖3）。

2.2 維生素C對大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖活力的影響

由圖4可見：正常培養(yǎng)的P2代細(xì)胞具備一定增殖能力，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)目逐漸增加；

圖1 腎小管上皮細(xì)胞的鏡下觀察形態(tài)

圖2 CK－18的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

圖3 腎小管上皮細(xì)胞的CK－18免疫組化染色結(jié)果（×200）

而P3代細(xì)胞增殖活性明顯下降，細(xì)胞在培養(yǎng)一段時間后不再繼續(xù)生長，甚至逐漸出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞總體數(shù)下降。在維生素C的作用下，P3代細(xì)胞可以維持一定的增殖活力，培養(yǎng)時間適度延長（P＜0.05），但是，各劑量之間沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差別（P＞0.05），如圖5所示。

圖4 腎小管上皮細(xì)胞的增殖活力分析結(jié)果

圖5 腎小管上皮細(xì)胞的增殖活力分析結(jié)果

3 討論

隨著細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外陸續(xù)誕生了多種不同種屬的腎小管細(xì)胞株，如：人HK－2細(xì)胞株、大鼠NRK－52EA細(xì)胞株等。這些細(xì)胞株在建系過程中的轉(zhuǎn)基因等永生化技術(shù)，可能會導(dǎo)致細(xì)胞與在體動物模型存在一定的差異，進(jìn)而對某些研究會產(chǎn)生影響［7，8］。而原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，盡管在傳代、培養(yǎng)方面較為不便，但細(xì)胞自身生物學(xué)特性與在體細(xì)胞更為相似，因此，優(yōu)化腎小管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，對一些體外實驗來說仍具有著較為重要的價值［6，9，10］。

本研究所用方法經(jīng)濟(jì)簡便，可用簡易方法適度提高腎小管上皮細(xì)胞的生命活性，延長培養(yǎng)時間。但是，本方法仍不能提高細(xì)胞的傳代次數(shù)，在維生素C存在的條件下，P4代細(xì)胞仍不能正常生長，也不能長期培養(yǎng)，僅前3代細(xì)胞可供體外分析實驗使用，因此，如何能在維持細(xì)胞自身特性的前提下，進(jìn)一步延長腎小管上皮細(xì)胞的傳代次數(shù)，仍需進(jìn)一步的探索和研究。

［1］Wichienkuer P，Naugler W，Wusirika R.Calciphylaxis in a patient with acute kidney injury and alcoholic cirrhosis［J］.Clin Nephrol，2011，76（6）：499.

［2］Wang J，Wang F，Yun H，et al.Effect and mechanism of fucoidan derivatives from Laminaria japonica in experimental adenine－induced chronic kidney disease［J］.J Ethnopharmacol，2012，139（3）：807.

［3］Inoue BH，dos Santos L，Pessoa TD，et al.Increased NHE3 abundance and transport activity in renal proximal tubule of rats with heart failure［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2012，302（1）：R166.

［4］Frohlich EM，Zhang X，Charest JL.The use of controlled surface topography and flow－induced shear stress to influence renal epithelial cell function［J］.Integr Biol（Camb），2012，4（1）：75.

［5］楊龍飛，朱 娜，宗敏茹，等.水通道AQP2在多囊腎上皮中的表達(dá)及意義［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，14（4）：490.

［6］劉曉玲，邢淑華.Percoll法分離培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，26（2）：100.

［7］Panchapakesan U，Pollock C，Saad S.Review article：impotance of the kidney proximal tubular cells in thiazolidinedione－mediated sodium and water uptake［J］.Nephrology （Carlton），2009，14（3）：298.

［8］毛慧娟，王笑云，徐昌芬，等.人腎近端小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代及鑒定方法研究［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，24（6）：561.

［9］馮樂平，喬 偉.順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞程序性死亡的機理［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，34（4）：581.

［10］Gong X，Celsi G，Carlsson K，et al.N－acetlylcysteine amide protects renal proximal tubular epithelial cells against iohexol－induced apoptosis by blocking p38 MAPK and iNOS signaling［J］.Am J Nephrol，2010，31（2）：178.