李 艷，黃小勇，鄧義波，黃 建，陳道邦 (四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041)

隨著現(xiàn)代微創(chuàng)外科的發(fā)展，醫(yī)生越來越重視術(shù)后病人的生活質(zhì)量，如何才能在手術(shù)中盡可能地保留手術(shù)部位殘留器官的功能以及減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生是醫(yī)生十分關(guān)注的問題。因此對(duì)器官壁內(nèi)神經(jīng)分布的了解有了更多的要求。一般對(duì)器官神經(jīng)支配的研究是采用大體和顯微外科解剖的方法，可以粗略顯示神經(jīng)在肌內(nèi)分布情況，但是隨著神經(jīng)的不斷分支，神經(jīng)纖維越來越細(xì)小，變得難以與血管和結(jié)締組織區(qū)別［1］。自從19 世紀(jì) Charles Sihler 采用 Sihler’s 神經(jīng)染色法進(jìn)行完整肌內(nèi)神經(jīng)研究以來，經(jīng)過學(xué)者的不斷改良［2-4］，到目前為止被認(rèn)為是完整肌內(nèi)神經(jīng)分支分布研究?jī)?yōu)先選擇的方法，主要應(yīng)用于研究哺乳動(dòng)物的骨骼肌。楊勝波等［5］用該法研究了人胃壁內(nèi)迷走神經(jīng)的分布;趙澤駒等［6］用該法研究了人膀胱肌內(nèi)的神經(jīng)支配及分布，認(rèn)為Sihler’s 神經(jīng)染色法也適用于研究平滑肌肌內(nèi)神經(jīng)的分布。但是在研究迷走神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)過程中沿胃大彎側(cè)切開胃，研究膀胱壁內(nèi)神經(jīng)時(shí)自膀胱尖沿膀胱長(zhǎng)軸縱行剪開膀胱前壁，這些切開破壞了器官結(jié)構(gòu)的整體性，有可能破壞神經(jīng)在切開區(qū)域的分布，且染色效果不好。本實(shí)驗(yàn)中在不切開中空器官的情況下應(yīng)用再改良的Sihler’s 染色法完整清晰顯示了神經(jīng)在器官壁內(nèi)的分布以補(bǔ)充解剖學(xué)的資料，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也為以后研究中空器官提供一定的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以合法途徑取得人食管標(biāo)本15 例，胃標(biāo)本15 例，膀胱標(biāo)本15 例。從舌骨平面到十二指腸上部取食管和胃，保留食管兩側(cè)的組織結(jié)構(gòu);切取膀胱并保留雙側(cè)輸尿管盆段約4 cm。生理鹽水沖洗，10%福爾馬林常溫固定6 周。

1.2 再改良的Sihler’s 肌內(nèi)神經(jīng)染色法

1.2.1 除色素 組織固定后用流水沖洗至無甲醛味，約10 h。沖洗胃、食管時(shí)可以從胃幽門處插乳膠管，沖洗膀胱時(shí)可以從尿道內(nèi)口插入帶有特制玻璃管的乳膠管，緩慢沖洗胃、食管、膀胱內(nèi)壁，水從食管端、輸尿管端流出。為了加快沖洗膀胱壁可在膀胱壁上插入兩個(gè)5 號(hào)針頭以便水流出。然后用3%KOH 加3% H2O2溶液灌入胃、食管、膀胱內(nèi)，除色素，液體變渾濁后及時(shí)更換，并隨時(shí)觀察標(biāo)本中神經(jīng)在器官壁內(nèi)變化，此過程約需 3 ～ 4 周。

1.2.2 脫鈣 標(biāo)本置于流水下沖洗 30 min，浸入 Sihler’sⅠ溶液進(jìn)行脫鈣，在胃、食管、膀胱內(nèi)灌入脫鈣液，約每4 d 換脫鈣液1 次。需要3 周左右至透明。

1.2.3 染色 脫鈣后的標(biāo)本在流水下沖洗30 min，在胃、食管、膀胱內(nèi)灌入染色液，浸入Sihler’sⅡ溶液染色，每1 ～2 周換染色液1 次，直至肌內(nèi)神經(jīng)染色為止，此過程需2 ～3 周。

1.2.4 脫色 將染好色的標(biāo)本置于流水下沖洗30 min，然后將標(biāo)本放入酸性分化液(由1 份鹽酸，100 份70%酒精溶液配制而成)進(jìn)行脫色，隨時(shí)在X 線片閱片箱下觀察肌內(nèi)神經(jīng)與肌肉顏色的對(duì)比度，直到肌內(nèi)神經(jīng)顯示紫藍(lán)色，肌肉呈棕紅色為止。此過程時(shí)間視標(biāo)本大小及肌肉厚度而不同。再次改良的方法不需要中和，脫色完畢后只需置于流水下沖洗30 min。

1.2.5 透明 剔除筋膜，然后將標(biāo)本依次放入40%、60%、80%、100%梯度甘油中進(jìn)行透明，及時(shí)更換甘油。每個(gè)梯度透明3 d，透明過程中注意觀察，進(jìn)行輕輕攪拌以透明均勻。避光保存在加入少許麝香草酚的100%甘油中。在X 線片閱片箱下仔細(xì)觀察肌內(nèi)神經(jīng)與血管的分支分布，照相。

2 結(jié)果

2.1 迷走神經(jīng)在食管的分布

經(jīng)染色處理后的食管成透明膠凍狀，迷走神經(jīng)在食管壁內(nèi)的走行清晰可見(圖1)。食管上段前壁神經(jīng)分支鮮見，后壁左右兩側(cè)均有迷走神經(jīng)分支穿入，且兩側(cè)的神經(jīng)分支之間有聯(lián)系，吻合成不規(guī)則的多邊形。兩側(cè)的迷走神經(jīng)在食管中下段的前、后壁形成豐富的神經(jīng)叢。右迷走神經(jīng)發(fā)出分支形成食管后叢，部分神經(jīng)纖維與左側(cè)迷走神經(jīng)形成食管前叢。左側(cè)迷走神經(jīng)分出的分支主要形成食管前叢，部分神經(jīng)纖維參與右側(cè)迷走神經(jīng)形成食管后叢。

圖1 食管壁迷走神經(jīng)的分布及分支間的聯(lián)系

2.2 胃迷走神經(jīng)的分支分布

染色后的胃成透明膠凍狀，神經(jīng)分支較細(xì)小，有胃底支、胃體支、幽門前支、幽門后支。分支間在臨近胃小彎1/3 處開始有分支，向胃大彎發(fā)出各級(jí)分支，呈扇形分支分布，且分支間有吻合聯(lián)系。在胃大彎側(cè)胃前支和胃后支有吻合(圖2)。

圖2 胃迷走神經(jīng)的分支分布

2.3 膀胱壁內(nèi)神經(jīng)的分支分布

染色后的膀胱成透明狀，在左右輸尿管附近有較多的神經(jīng)分布，向前下走行，沿途發(fā)出分支，分支間有交叉連接，支配膀胱兩側(cè)面及膀胱尖。右側(cè)輸尿管附近神經(jīng)較左側(cè)多。左右輸尿管口之間有較多的神經(jīng)纖維分布，神經(jīng)纖維向前延伸(圖3)。膀胱三角區(qū)神經(jīng)密集，是否和膀胱三角區(qū)一些疾病的發(fā)生存在聯(lián)系，有待進(jìn)一步研究。膀胱前壁神經(jīng)分布較少。

圖3 膀胱壁內(nèi)神經(jīng)的分支分布

3 討論

Sihler’s 染色法是目前研究骨骼肌內(nèi)神經(jīng)分布的優(yōu)先選擇方法，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，此法不僅適用于骨骼肌肌內(nèi)神經(jīng)的染色，同樣適用于平滑肌肌內(nèi)神經(jīng)的染色。雖然楊勝波、趙澤駒等［5-6］用該法研究了胃和膀胱壁內(nèi)的神經(jīng)分布，但是都不同程度地破壞了器官的完整性。現(xiàn)就Sihler’s 神經(jīng)染色法在空腔器官中的應(yīng)用以及筆者在實(shí)驗(yàn)中的一些經(jīng)驗(yàn)加以討論。

3.1 關(guān)于空腔器官的固定

王林波等［7］在消化道腫瘤切緣伸縮性的研究中指出:空腔器官離體后就有不同程度的回縮，切除標(biāo)本離體后食管回縮44.5%、胃回縮13.6%。標(biāo)本在固定的過程中又有一定的回縮，不同的器官回縮率不等，以固定后6 ～8 h 回縮率明顯，超過12 h 后標(biāo)本基本不再回縮。因此在固定空腔器官時(shí)，應(yīng)當(dāng)把空腔器官內(nèi)腔用生理鹽水沖洗干凈，在腔內(nèi)灌入適量固定劑使空腔器官處于適當(dāng)充盈狀態(tài)以維持器官的正常形態(tài)。固定1周后固定液渾濁要更換固定液。

3.2 器官的除色素

在用流水沖洗的過程中，為了加快甲醛被沖洗去除的速度，可以在空腔器官內(nèi)放置連有特制玻璃管的乳膠管。沖洗后向空腔內(nèi)灌入適量除色素的液體以加快除色素的速度和保證除色素內(nèi)外壁均勻。不需要切開空腔器官以保證器官的完整性。在除色素的過程中器官組織會(huì)變軟，組織間隙也會(huì)增大，因此每次換液時(shí)操作要輕柔以免折斷在器官外的神經(jīng)干。

3.3 除鈣和染色

在除鈣和染色的過程中，每次流水沖洗時(shí)都應(yīng)該沖洗器官的內(nèi)壁，除鈣液和染色液都要適量灌入空腔器官內(nèi)以達(dá)到器官除鈣和染色均勻。由于空腔器官軟化后體積增大，壁變薄，在X 線片閱片箱上觀察時(shí)器官也應(yīng)灌入適量相應(yīng)的液體，以免空腔器官前后壁重疊，影響觀察效果。

3.4 脫色與透明

在脫色的過程中，器官腔內(nèi)灌入適量脫色液使壁內(nèi)、壁外同時(shí)脫色，脫色過程中，標(biāo)本放在適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)在搖床上震蕩以脫色均勻。據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn):支配空腔器官壁內(nèi)的神經(jīng)相對(duì)細(xì)小。在脫色的過程中要不斷觀察，及時(shí)終止脫色過程以防脫色過度。使用的酸性分化液脫色快，其中含有的70%酒精具有部分脫水作用，脫色的過程中有透明效果，脫色后就可以看到神經(jīng)之間的細(xì)小分支。透明過程中，不同梯度濃度的甘油適量灌入器官腔內(nèi)增加透明的速度，標(biāo)本完全浸泡在甘油溶液中。標(biāo)本在低濃度的甘油溶液中會(huì)有部分脫色，注意觀察，適當(dāng)縮短標(biāo)本在低濃度甘油溶液中的時(shí)間。拍照時(shí)，避免器官壁重疊，在器官腔內(nèi)灌入適量100%的甘油。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用Sihler’s 染色法對(duì)骨骼肌進(jìn)行了大量的研究，但該方法本身也有局限性［8］。其優(yōu)點(diǎn)首先是，Sihler’s 染色法能在不切開或者不對(duì)標(biāo)本切片的條件下，在完整的標(biāo)本上觀察到細(xì)小神經(jīng)。其次，可以顯示神經(jīng)分支之間的聯(lián)系。再者，整體染色不需要切片，能夠清楚顯示相鄰結(jié)構(gòu)之間的毗鄰關(guān)系。可以同時(shí)觀察到內(nèi)在神經(jīng)和動(dòng)脈血管。Sihler’s 染色法還是存在一定的局限:①不能區(qū)分運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元，只是選擇性的使包繞神經(jīng)軸突的髓鞘著色，神經(jīng)種類的辨別只能追蹤到穿入標(biāo)本的神經(jīng)干。②與其他實(shí)驗(yàn)方法相比，該方法十分費(fèi)時(shí)，并且成功與否與實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)相關(guān)。每一步驟的終止都依賴于實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)。③由于是整體標(biāo)本的染色方法，染色的質(zhì)量會(huì)隨著標(biāo)本的大小和肌肉厚薄的不同而有差異。王啟明等［9］通過對(duì) Sihler’s 染色法中固定、脫色、除鈣、透明這幾個(gè)步驟改良，研究家兔不同形態(tài)肌的神經(jīng)分布，得出再改良后的Sihler’s 肌內(nèi)神經(jīng)染色法較再改良前更省時(shí)、更經(jīng)濟(jì)、更實(shí)用。但是總體來看整個(gè)染色過程還是較長(zhǎng)。

隨著修復(fù)重建外科以及微創(chuàng)外科等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，對(duì)肌內(nèi)和中空器官壁內(nèi)神經(jīng)分支分布有了更高的要求，Sihler’s 染色技術(shù)的開展可以指導(dǎo)選擇和切取部分肌肉用作移植，盡最大可能地減少肌肉內(nèi)的神經(jīng)損傷，保證肌肉移植后具有正常的神經(jīng)支配，以重建其運(yùn)動(dòng)功能，盡可能地保留供區(qū)的各項(xiàng)功能。1964 年Nielsen［10］指出:迷走神經(jīng)切斷治療十二指腸潰瘍可以引起膽結(jié)石的形成，同時(shí)胰腺的降低分泌反應(yīng)，失去胰島素反應(yīng)，小腸擴(kuò)張，腸絨毛減少，脂肪的吸收降低。研究中空器官壁內(nèi)的神經(jīng)分支分布有助于臨床工作中對(duì)中空器官手術(shù)入路和手術(shù)方式的選擇，最大限度地保護(hù)手術(shù)區(qū)器官功能，同時(shí)保留與相鄰器官之間的功能關(guān)系。本文認(rèn)為Sihler’s 染色法的進(jìn)一步應(yīng)用和改良尚需要深入探索。

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