■郭 威 郭曉軍 袁洪水 王星懿 王世英 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071000）

酶制劑[1]是酶經(jīng)過提純、加工后的具有催化功能的生物制品，近年來一直是國內外動物營養(yǎng)研究的熱點之一。脂肪酶作為工業(yè)酶制劑中重要的生物催化劑之一，在飼料行業(yè)中有著廣泛的研究潛力和應用前景。王琰等[2]建立了具有陜西特色的應用于飼料行業(yè)的微生物脂肪酶菌種庫，K.Nar?reborg等[3]研究了豬胰脂肪酶粗提物與膽汁鹽對脂肪消化的影響，均處于起步階段。

脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中[4]。目前已發(fā)現(xiàn)至少有60多個屬的微生物可以產(chǎn)生脂肪酶[5]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物脂肪酶可提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，減輕斷奶仔禽、仔畜的營養(yǎng)應激[6]，比動物脂肪酶酶解作用的pH值和溫度范圍更寬，便于工業(yè)化生產(chǎn)獲得高純度酶制劑[7]，因此成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要來源。

據(jù)報道，微生物是有效的脂肪酶產(chǎn)生者，并且霉菌能夠產(chǎn)生大量的脂肪酶[8]。本文從富含油脂的土壤中分離到1株產(chǎn)脂肪酶的真菌，經(jīng)鑒定屬于黑曲霉屬，命名為GW-1，同時對該菌株的產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，獲得了其最佳產(chǎn)酶條件。本試驗將為酶制劑的生產(chǎn)提供重要的種質資源，并為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

土樣采自河北農(nóng)業(yè)大學餐廳周圍富含油脂的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g、NH4NO30.1 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、K2HPO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.1g，10 ml橄欖油。用0.1 mol/l NaOH 調節(jié)溶液pH值至8.0。

種子培養(yǎng)基：（NH4）2SO45.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖20 g、蛋白胨25 g、橄欖油10 ml、蒸餾水1 000 ml，pH值8.0，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO41.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、NaH2PO41.0 g、K2HPO42.0 g、橄欖油10 ml、黃豆粉 20 g、蔗糖 10 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值8.0，115℃滅菌30 min。

分離初篩培養(yǎng)基[9-10]：(NH4)2SO40.5 g、NH4NO30.1 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、K2HPO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、瓊脂20 g，溴甲酚紫2 mg，蒸餾水1 000 ml、pH值8.0，121 ℃滅菌15 min后，于60℃左右加含溴甲酚紫的聚乙烯醇橄欖油乳化液（12 ml/100 ml）。

橄欖油乳化液的配制：將橄欖油與2%的聚乙烯醇溶液按1∶3（v/v）混合，4℃靜置1 h后于組織攪拌機中高速勻漿3 min即得。

斜面保藏培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基[10]）：馬鈴薯200.0 g/l，蔗糖 20.0 g/l、瓊脂20.0 g/l。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的篩選

將采集的土壤進行富集培養(yǎng)[10]、平板分離和搖瓶發(fā)酵復篩[7]，將產(chǎn)酶能力較高菌株挑選出來供進一步試驗。

1.2.2 脂肪酶活力測定

采用橄欖油乳化液方法[11]測定脂肪酶活力。

酶活力單位定義：37℃、pH值7.0條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個脂肪酶國際單位（U）[11-12]。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學鑒定[13]

觀察真菌菌落形態(tài)、顏色、有無色素產(chǎn)生等特征，根據(jù)《常見與常用真菌》進行菌種鑒定。

1.2.3.2 分子生物學鑒定

以該菌株的基因組DNA為模板進行ITS基因序列分析[14]，PCR擴增其ITS序列，PCR擴增產(chǎn)物送北京福爾徹科技有限公司進行測序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast分析比對，并構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 產(chǎn)脂肪酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗

通過單因素試驗確定產(chǎn)脂肪酶菌株產(chǎn)酶的最佳碳源、氮源、無機鹽和誘導物。

1.2.4.2 正交試驗

培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響分別按正交試驗表L9(34)設計進行。

2 結果

2.1 菌種篩選

土樣經(jīng)富集、涂布平板后分離得到13株產(chǎn)脂肪酶菌株,經(jīng)搖瓶發(fā)酵復篩得到產(chǎn)酶能力較強的GW-1菌株，經(jīng)測定酶活達到19.86 U/(ml·min)。該菌在溴甲酚紫篩選培養(yǎng)基上形成明顯水解圈(見圖1),故選擇GW-1作為后續(xù)試驗研究菌株。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

菌株GW-1在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2～5 d。菌落迅速蔓延，初為白色，后變成鮮黃色直至褐色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色，見圖2。

結合以上GW-1菌落形態(tài)觀察，符合黑曲霉菌的相關描述，初步確定GW-1菌可能為黑曲霉菌。

2.2.2 菌株的分子學鑒定

以菌株GW-1的基因組DNA為模板，采用真菌ITS序列通用引物進行PCR擴增，在700 bp處有一條特異性條帶（見圖3）。PCR產(chǎn)物測序結果表明，片段長787 bp，有典型的ITS序列特征。

圖1 菌株GW-1在溴甲酚紫培養(yǎng)基上形成明顯水解圈

圖2 菌株GW-1菌落形態(tài)

圖3 GW-1菌株的ITS序列PCR產(chǎn)物電泳

將得到的擴增序列在NCBI網(wǎng)站上進行序列同源性比對。取與GW-1菌一致性在99%以上的序列，用MEGA5.0進行多序列比對并構建基因進化樹(見圖4)。結果顯示，菌株GW-1與菌株CASMBSEF 15位于同一族群，親緣關系最近，表明菌株GW-1屬于曲霉菌屬的Aspergillus niger。因此，將該菌命名為Aspergillus niger GW-1。

圖4 GW-1菌株的ITS rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 GW-1菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 碳源對GW-1菌株產(chǎn)酶的影響（見圖5）

圖5 碳源對產(chǎn)酶的影響

將菌株在不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液脂肪酶活力，結果表明，碳源為麥芽糖和葡萄糖時該菌株產(chǎn)酶能力較高。由于兩者酶活相當，故考慮到成本問題，選用葡萄糖作為最佳碳源。

2.3.1.2 氮源對GW-1菌株產(chǎn)酶的影響（見圖6）

將菌株在不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液脂肪酶活力，結果表明，菌株在5種氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)脂肪酶活力依次為黃豆粉＞蛋白胨＞酵母膏＞尿素＞牛肉膏。因此，GW-1菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源為黃豆粉。

圖6 氮源對產(chǎn)酶的影響

2.3.1.3 金屬離子對GW-1菌株產(chǎn)酶的影響(見圖7)

圖7 金屬離子對產(chǎn)酶的影響

將菌株在含有不同金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液脂肪酶活力。結果表明，Mg2+對該菌株產(chǎn)酶有明顯的促進作用，K+和Cu2+也有不同程度的促進作用，而Fe2+、Na+、Zn2+、Mn2+和Ca2+分別有不同程度的抑制作用，其中Mn2+抑制作用最強，這與亓小宇報道的結果相一致[15]。

2.3.1.4 誘導物對GW-1菌株產(chǎn)酶的影響（見圖8）

圖8 誘導物對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同種類的油脂作為脂肪酶的誘導劑，研究不同種類油脂對該菌株產(chǎn)酶的影響。結果表明，以橄欖油作為誘導劑效果最佳，是未添加誘導油脂的7.6倍。

2.3.2 正交試驗

2.3.2.1 培養(yǎng)基組分配比正交試驗

根據(jù)單因素的優(yōu)化結果選取葡萄糖為碳源、黃豆粉為氮源、MgSO4·7H2O為無機鹽，橄欖油為誘導物，改變碳、氮源以及無機鹽和誘導物的濃度，進行正交試驗，搖床振蕩培養(yǎng)4 d，試驗結果見表1。

表1 培養(yǎng)基組分配比正交試驗結果分析

對表1中的數(shù)據(jù)進行直觀分析，得知各因素極差大小為R誘導物＞R無機鹽＞R氮源＞R碳源，即培養(yǎng)基中影響產(chǎn)酶的各因素主次順序為：誘導物、無機鹽、氮源、碳源。因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5%、黃豆粉2.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、橄欖油1%。菌株GW-1在此最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵測得的酶活為26.84 U/ml。

2.3.2.2 培養(yǎng)條件正交試驗

以0.5%葡萄糖、2.0%黃豆粉、0.1%MgSO4·7H2O、1%橄欖油配制培養(yǎng)基，考察pH值、培養(yǎng)時間、裝液量和接種量對GW-1菌株產(chǎn)酶的影響。對發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，經(jīng)過不同培養(yǎng)時間的搖床培養(yǎng)，按照不同的接種量，再將其分別接種到不同pH值和裝液量的發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)4 d后測定酶活力。結果表明，不同培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶有著重要影響(見表2)。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗結果分析

對表2中數(shù)據(jù)直觀分析得知，各因素極差的大小為RB＞RA＞RC＞RD，培養(yǎng)條件中影響脂肪酶產(chǎn)生的各因素主次順序為：B＞A＞C＞D，最佳的組合是A3B1C2D2。

由于正交試驗處理中不包含有上述工藝條件組合,為此選取最佳A3B1C2D2組合和相近組合,即正交試驗中脂肪酶產(chǎn)生最多的組合7在同等條件下進行驗證。如表3所示，最佳組合脂肪酶酶活達到了39.82 U/(ml·min)，而組合7的脂肪酶酶活為32.64 U/(ml·min)，因此培養(yǎng)條件的最佳組合為初始培養(yǎng)基pH值9.0、培養(yǎng)時間4 d、接種量8%、裝液量50 ml/250 ml，在此優(yōu)化條件下脂肪酶酶活達到39.82 U/(ml·min)。

3 討論

3.1 菌株的篩選與鑒定

產(chǎn)脂肪酶的微生物廣泛分布在細菌、真菌和放線菌中。國內已進行了很多有關脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選研究，已報道的菌株主要集中在假單胞菌屬[16]、根霉屬[17]和青霉屬[9]等。本試驗分離篩選獲得的產(chǎn)酶菌株根據(jù)ITS基因序列并結合形態(tài)學鑒定為黑曲霉Aspergillus niger，而目前關于此屬菌株能夠產(chǎn)脂肪酶的研究報道很少，且黑曲霉有著發(fā)酵成本較低、較易成活等優(yōu)勢，具有較大的開發(fā)潛力和進一步深入研究的價值。

據(jù)報道，使用三丁酸甘油酯和吐溫這樣的人工脂質作為底物來檢測脂肪酶活性被廣泛推薦使用，但它們可能被酯酶水解而產(chǎn)生假陽性結果[18]。本文采用的橄欖油乳化法具有快速、靈敏的特點，由于使用天然底物故能篩選出真正產(chǎn)脂肪酶的菌株。

薛靜等[19]報道的菌株09-7-1優(yōu)化后脂肪酶活力達24.112 U/ml。趙偉等[20]報道的菌株CS1-1最大酶活達（37.6±0.8）U/ml。本研究獲得的菌株GW-1在優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中粗酶活力可以達39.82 U/（ml·min），較上述報道的菌株脂肪酶活力高，充分顯示了該菌株在產(chǎn)脂肪酶能力上的優(yōu)越性。

3.2 碳源、氮源、金屬離子及誘導物對GW-1菌株產(chǎn)酶的影響

關于碳源、氮源對細菌產(chǎn)酶活性的影響，一些研究指出以葡萄糖為碳源可獲得理想的發(fā)酵效果[15]，本試驗結果與其基本一致；另外，報道中脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)多采用牛肉膏為氮源[21]，而本試驗所選細菌以黃豆粉為氮源時，產(chǎn)酶效果明顯好于以牛肉膏為氮源，這可能是因為微生物種類不同所致，并且也降低了生產(chǎn)成本。

與Rohit等[22]報導的結果相一致，本研究獲得的菌株GW-1產(chǎn)酶依賴Mg2+濃度，添加微量Mg2+時產(chǎn)酶活性最高，但濃度過大會抑制該菌株的產(chǎn)酶活性。Fe2+、Na+、Zn2+和 Mn2+有不同程度的抑制作用，這種抑制效應可能是由于金屬離子改變了酶活性部位的構象所引起。

大多數(shù)水解酶類是誘導酶，很多菌株產(chǎn)生的脂肪酶也多屬于誘導酶，在培養(yǎng)基中添加適量油脂、表面活性劑及其某些結構類似物可有效促進產(chǎn)脂肪酶菌產(chǎn)酶或提高酶活性[23]。在體積分數(shù)為1%橄欖油的條件下產(chǎn)酶可提高7.6倍，但過多的橄欖油又會抑制脂肪酶的產(chǎn)生，這可能是因為油脂降解后的脂肪酸對脂肪酶有阻遏抑制的作用。

4 結論

獲得1株高產(chǎn)脂肪酶真菌，該菌株產(chǎn)脂肪酶的報道較少。

通過正交試驗，該菌株GW-1產(chǎn)酶活力較優(yōu)化前提高了100.50%。