劉曉玲 ， 王金晶 ， 李永仙 ， 李 崎 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

β-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）主要來(lái)源于植物與微生物，能夠有效切割禾本科植物胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，因此在啤酒釀造及飼料工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1]。在麥汁糖化過(guò)程中適量添加外源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶可以有效提高糖化得率，加快糖化醪的過(guò)濾速率、降低能耗，而且能夠使成品啤酒的非生物渾濁現(xiàn)象得以緩解[2]。在飼料中適量添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶可以幫助動(dòng)物消化飼料中的β-葡聚糖，提高飼料的利用率并減少動(dòng)物腸道疾病的發(fā)生[3]。

隨著國(guó)內(nèi)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)的啤酒釀造與飼料工業(yè)的發(fā)展速度也逐漸加快，而β-1，3-1，4-葡聚糖酶的需求量也勢(shì)必會(huì)越來(lái)越大。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常見(jiàn)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要由真菌發(fā)酵產(chǎn)生，且多為國(guó)外的酶制劑公司生產(chǎn)，價(jià)格較為昂貴，這將嚴(yán)重制約行業(yè)的發(fā)展，因此分離篩選具高效產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶能力的菌株并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐具有重大意義。芽孢桿菌由于其非致病性、胞外蛋白分泌能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速率快等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為酶制劑工業(yè)研究的熱點(diǎn)。作者以實(shí)驗(yàn)室分離篩選的一株芽孢桿菌Bacillus tequilensis CGX5-1為目的菌，通過(guò)研究其生長(zhǎng)規(guī)律并對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)中試發(fā)酵以及工業(yè)化應(yīng)用提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

特基拉芽孢桿菌CGX5-1（Bacillus tequilensis CGX5-1）:由江南大學(xué)生物工程學(xué)院啤酒與釀造食品實(shí)驗(yàn)室分離，并已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.5935。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂粉 15；pH 6.5～7.0。

1.2.2 種子培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂粉 15；pH 6.5。

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 玉米粉30，豆餅粉40， 大麥粉 50，KH2PO42，CaCl20.2，MgSO40.98，pH 7.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1）斜面活化:將保存的菌種在斜面上劃線(xiàn)并于37℃條件培養(yǎng)14 h，待斜面上長(zhǎng)出菌苔即為活化的種子。

2）種子培養(yǎng):250 mL三角瓶種子培養(yǎng)基裝液量30 mL（121℃滅菌20 min，冷卻），從活化斜面上挑取一環(huán)菌接種搖瓶，37℃ 200 r/min，培養(yǎng)12 h。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 向裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接入體積分?jǐn)?shù)3%的種子液，搖瓶培養(yǎng)。從0～22 h間隔2 h取樣測(cè)定菌液在600 nm處的OD值。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵 250 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量 30 mL（121℃滅菌 20 min，冷卻），以 3%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)移新鮮的種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃200 r/min，培養(yǎng)。

1.3.4 產(chǎn)酶曲線(xiàn)的測(cè)定 向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)3%新鮮的種子液，搖瓶培養(yǎng)。前48小時(shí)每隔12 h取樣，至48 h時(shí)每隔4 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液上清液中β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶活。

1.3.5 β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活測(cè)定方法 發(fā)酵液8 000 r/min離心3 min后取出上清液，用蒸餾水稀釋合理倍數(shù)后，于40℃預(yù)熱。 用等體積預(yù)熱至40℃的 20 mmol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液稀釋Megazyme公司的藍(lán)色β-葡聚糖溶液。取0.1 mL稀釋酶液加入0.4 mL藍(lán)色β-葡聚糖底物中，于40℃反應(yīng)10 min后向每個(gè)樣品中加入3 mL沉淀液 （由硫酸鋅、乙二醇甲醚、鹽酸、乙酸鈉配制而成）后立即混勻，靜置5 min后離心，測(cè)定上清液A590值，對(duì)照組為先加入沉淀液后加入藍(lán)色β-葡聚糖底物的稀釋酶液。β-葡聚糖酶酶活力的定義為:1 mL發(fā)酵液于40℃、pH 6.5，每分鐘分解大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖定義為 1個(gè)酶活單位（U）。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （Fractional Factorial Design，F(xiàn)FD） 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種部分析因篩選方法，可在少量的實(shí)驗(yàn)中對(duì)多個(gè)變量進(jìn)行考察，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析篩選出對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的實(shí)驗(yàn)變量。

作者選取大麥粉、玉米粉、豆餅粉、KH2PO4、MgSO4和CaCl2作為待篩選因素，部分因子實(shí)驗(yàn)選擇26-2部分重復(fù)因子設(shè)計(jì)，每一獨(dú)立變量在高（+1）和低（-1）兩個(gè)水平上進(jìn)行，高水平為低水平1.5倍。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 部分因子設(shè)計(jì)編碼值及水平Table 1 Code and level of fractional factorial design

1.4.2 最速上升實(shí)驗(yàn) 利用部分因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)找到對(duì)產(chǎn)物合成影響最大的因素后，需要進(jìn)一步對(duì)這些因素進(jìn)行分析。其中最常用的分析方法是響應(yīng)面分析，但響應(yīng)面分析是一種局部的分析方法，只實(shí)用于一定范圍內(nèi)根據(jù)實(shí)驗(yàn)求得最優(yōu)解。所以在進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行最速上升實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)值附近的區(qū)域，在區(qū)域內(nèi)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 中心組合設(shè)計(jì)是一種國(guó)際上比較常見(jiàn)的水平數(shù)為5的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。實(shí)驗(yàn)完成后，通過(guò)響應(yīng)面分析可以對(duì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的因素及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且還能對(duì)各因子的濃度進(jìn)行優(yōu)化，以獲得影響過(guò)程的最佳條件。在部分因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選出對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶產(chǎn)量影響顯著的因子，進(jìn)行中心組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Minitab 16.0處理。

1.4.4 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 使用優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力，并與響應(yīng)面分析得到的理論值進(jìn)行比較，以得到最佳培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

菌株培養(yǎng)過(guò)程中菌液的OD600隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。由圖1可知，B.tequilensis CGX5-1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在培養(yǎng)過(guò)程中的第4～12小時(shí)之間，0～4 h為延滯期，4～12 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h以后達(dá)到平衡期。選取對(duì)數(shù)后期即培養(yǎng)10～12 h的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，此時(shí)的菌體生長(zhǎng)旺盛，繁殖速度較快，為理想的生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖1 B.tequilensis CGX5-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of B.tequilensis CGX5-1

2.2 產(chǎn)酶曲線(xiàn)

為了更好地監(jiān)控菌體在發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)酶情況，使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵并測(cè)定β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活的變化情況。結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌體在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)52 h后其產(chǎn)酶量達(dá)到頂點(diǎn)，因此選取發(fā)酵52 h點(diǎn)測(cè)定發(fā)酵液中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力。

圖2 B.tequilensis CGX5-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶曲線(xiàn)Fig.2 Curve of β-glucanase production of B.tequilensis CGX5-1 in fermentation medium

2.3 部分因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

選取N=6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組3個(gè)平行，響應(yīng)值為 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力，結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of fractional factorial design

對(duì)部分因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析表明，大麥粉、玉米粉和豆餅粉對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶合成具有正效應(yīng)，故對(duì)這3個(gè)因素取高水平值。而KH2PO4、MgSO4和CaCl2具有負(fù)效應(yīng)，故對(duì)其取低水平值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。其中p值小于0.05的因素可認(rèn)為其對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較顯著。由此可知大麥粉和豆餅粉對(duì)于β-1，3-1，4-葡聚糖酶的合成是顯著影響因子。由回歸分析結(jié)果可得一次擬合線(xiàn)性回歸方程:

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕貧w方程決定系數(shù)R2=90.18%，調(diào)整決定系數(shù)Adj R2=83.67%，說(shuō)明模型可以較好地解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3 部分因子實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table3 Resultsofregression analysisin fractional factorial design

2.4 最速上升實(shí)驗(yàn)

從方程 （1）中大麥粉和豆餅粉的系數(shù)（x1:8.704，x3:9.957）得出這兩個(gè)因素步移的步長(zhǎng)之比為（0.874∶1），即當(dāng)豆餅粉步移 1 個(gè)單位（5 g/L）時(shí)，大麥粉步移（4.37 g/L）。以部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)作為步移的起點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最速上升實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent experiments

以上實(shí)驗(yàn)利用部分因子設(shè)計(jì)確定了大麥粉和豆餅粉兩個(gè)顯著影響因素，又利用最速上升實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)的取值范圍。此部分研究利用基于中心組合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析法對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.5 中心組合實(shí)驗(yàn)

中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，共有13個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。13個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類(lèi):一類(lèi)為析因點(diǎn)，即自變量取值在X1、X2所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共8個(gè)析因點(diǎn)；另一類(lèi)為零點(diǎn)，即區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental design and results of central composite design

以大麥粉和豆餅粉為自變量，以β-葡聚糖酶活力為響應(yīng)值，利用Minitab 16.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表6。所得數(shù)學(xué)模型見(jiàn)方程（2）。

其中:Y為響應(yīng)值 （β-葡聚糖酶酶活）；X1為大麥粉質(zhì)量濃度；X2為豆餅粉質(zhì)量濃度?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析表明，方程一次項(xiàng)與二次項(xiàng)的p值均小于0.05，說(shuō)明大麥粉與豆餅粉的單獨(dú)影響與交互影響都較為顯著。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕貧w方程決定系數(shù)R2=98.59%，調(diào)整決定系數(shù)Adj R2==97.58%，說(shuō)明模型可以很好的解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.6 響應(yīng)面分析

本研究在中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的參數(shù)取值范圍基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，在實(shí)驗(yàn)取值范圍內(nèi)兩圖都有最大值（響應(yīng)面的頂點(diǎn)和等高線(xiàn)的最高點(diǎn)），即兩因子間的相互作用是有利于β-葡聚糖酶產(chǎn)生的最優(yōu)組合。利用Minitab 16.0軟件自帶的分析預(yù)測(cè)功能對(duì)兩個(gè)因素的最佳值進(jìn)行尋優(yōu)，得到當(dāng)X1=68.4 g/L與X2=61.1 g/L時(shí)，響應(yīng)值β-葡聚糖酶酶活有最大值，預(yù)測(cè)值為192.27 U/mL。

至此經(jīng)過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定B.tequilensis CGX5-1發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的培養(yǎng)基組成為:大麥粉 68.4 g/L，玉米粉 40 g/L，豆餅粉 61.1 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.1 g/L。

圖3 響應(yīng)曲面與等值線(xiàn)Fig.3 Response surface and isoline

2.7 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，將初始發(fā)酵培養(yǎng)基及響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基在相同的發(fā)酵條件下進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 培養(yǎng)基優(yōu)化前后的β-葡聚糖酶產(chǎn)量的比較（n=3）Table 6 Comparison of β-glucanase production before and after optimization of fermentation medium

表6的結(jié)果表明，培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，β-葡聚糖酶活力（191.96 U/mL）與初始培養(yǎng)基（100.54 U/mL）相比，提高至原酶活的1.91倍。與預(yù)測(cè)值192.27 U/mL較為接近，相對(duì)誤差為0.16%，同時(shí)證明了回歸方程的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的有效性。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)研究，確定了野生特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis CGX5-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及發(fā)酵產(chǎn)酶曲線(xiàn)，在此基礎(chǔ)上利用部分因子實(shí)驗(yàn)、最速上升、中心組合以及響應(yīng)面分析等實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合Minitab 16.0軟件，最終得到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，相較于初始發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基更適合于該菌產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶。培養(yǎng)基組分中的大麥粉含有較高的葡聚糖含量，對(duì)β-葡聚糖酶的產(chǎn)生具有一定的誘導(dǎo)作用，同時(shí)作為碳源。而豆餅粉作為氮源，不僅廉價(jià)易得而且絕對(duì)氮的含量較高，為菌體的生長(zhǎng)繁殖以及胞外酶類(lèi)的產(chǎn)生提供不可或缺的營(yíng)養(yǎng)。本研究?jī)?yōu)化所得的培養(yǎng)基材料廉價(jià)易得，為日后菌種工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]Antoni P．Bacterial 1，3-1，4-β-glucanases:structure，function and protein engineering[J]．Biochemical et Biophysica Acta，2000，1543:361-382．

[2]李永仙，顧國(guó)賢，俞中．耐高溫 β-葡聚糖酶在啤酒糖化中的應(yīng)用研究[J]．釀酒，2002，29（2）:81-83．LI Yong-xian，GU Guo-xian，YU Zhong，et al．The application of thermal-β-Glucanase in Mashing[J]．Liquor Making，2002，29（2）:81-83．（in Chinese）

[3]Frost．The early dynamic response of the calf ileal epithelium to salm nella typhim urium[J]．Vet Pathol，1997，31:369-386．

[4]楊輝，廖威，梁海秋，等．葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的分離鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[J]．廣西大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，28（6）:89-92．YANG Hui，LIAO Wei，YANG Hai-qiu，et al．The isolation and identification of a high-productive strain of dextranase and its optimum medium of flask fermentation[J]．Journal of Guangxi University，2003，28（6）:89-92．（in Chinese）

[5]鄭元平，袁康培，馮明光．啤酒用β-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12（3）:316-321．ZHENG Yuan-ping，YUAN Kang-pei，F(xiàn)ENG Ming-guang．Breeding of a bacterial strain for efficient production of beer-purpose β-glucanase and the optimized conditions for its fermentation[J]．Journal of Agricultural Biotechnology，2004，12 （3）:316-321．（in Chinese）

[6]李文婧，趙祥穎，田延軍，等．γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（3）:108-112．LI Wen-jing，ZHAO Xiang-yin，TIAN Yan-jun，et al．Optimization of γ-PGA fermentation medium of Bacillus amyloliquefaciens by response surface methodology[J]．Food and Fermentation Industries，2010，36（3）:108-112．（in Chinese）

[7]Xingjun Tang，Guoqing He，Qihe Chen，et al．Medium optimization for the production of thermal stable β-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology[J]．Bioresource Technology，2004，93:175-181．

[8]李勇昊，周長(zhǎng)海，丁雷，等．發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化策略[J]．北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，25（2）:53-59．LI Yong-hao，ZHOU Chang-hai，DING Lei，et al．Strategies for optimization of fermentation medium composition performance[J]．Journal of Beijing Union University:Natural Sciences，2011，25（2）:53-59．（in Chinese）

[9]暢曉潔，鄭必勝，趙欣．裂褶菌產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化研究[J]．食品工業(yè)科技，2012，33（5）:167-173.CHANG Xiao-jie，ZHENG Bi-sheng，ZHAO Xin，et al．Study on the optimization of medium composition of endo-β-1，3-glucanase producing by Schizophyllum commune Fr[J]．Science and Technology of Food Industry，2012，33（5）:167-173．（in Chinese）

[10]沈海萍，吳曉剛，王曉丹，等．β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌的選育及培養(yǎng)基的初步優(yōu)化[J]．中國(guó)釀造，2011（226）:55-57．SHEN Hai-ping，WU Xiao-gang，WANG Xiao-dan，et al．Screening of β-glucanase-producing microorganisms and medium optimization for β-glucanase production[J]．Journal of China Brewing，2011（226）:55-57．（in Chinese）

[11]周德慶．微生物學(xué)教程[M]．北京:高等教育出版社，2002:92-93．

[12]Bhunia B，Behera K，Baquee A，et al．Optimization of alkaline protease activity from Bacillus subtilis 2724 by response surface methodology （RSM）[J]．International Journal of Biological Sciences and Engineering，2010，1（3）:158-169．