賈慶華

癌干細(xì)胞是癌組織中存在的具有自我更新能力、分化潛能的細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵［1］。近年來，癌干細(xì)胞學(xué)說提出由于癌干細(xì)胞在機(jī)體中快速復(fù)制，促使腫瘤細(xì)胞數(shù)量和瘤體體積擴(kuò)張并侵入鄰近組織及遷徙至機(jī)體其他組織器官，引起組織器官功能紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。由此可見，深入研究癌干細(xì)胞生物學(xué)特性，探索靶向治療方法，對惡性腫瘤的治愈具有重大臨床意義。本文介紹了癌干細(xì)胞特征、分選和鑒定及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，描述了各種癌干細(xì)胞研究進(jìn)展以及臨床應(yīng)用，并對目前存在的問題和展望進(jìn)行了探討。

1 癌干細(xì)胞的特性

1.1 自我更新 癌干細(xì)胞通過產(chǎn)生和自身相似的子代細(xì)胞以維系腫瘤的持續(xù)生長［2］。癌干細(xì)胞積累了所在腫瘤的基因突變，正是這些基因突變導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的過度增殖，乃至轉(zhuǎn)移播散?，F(xiàn)在有部分觀點(diǎn)指出腫瘤不斷生長是由于干細(xì)胞自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制中的某些基因發(fā)生紊亂，使得腫瘤組織中具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量不斷增加，腫瘤組織不斷增大［3］。此外，調(diào)控癌干細(xì)胞自我更新的幾個(gè)重要信號通路發(fā)揮著重要作用，如Notch、Wnt/β-Catenin、mTOR和Shh等，如果信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路本身或者其中任一成員發(fā)生變化使其不正?；罨瘯r(shí)，都可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［4-7］。

1.2 分化潛能 癌干細(xì)胞分化潛能的重要特征與干細(xì)胞相似。癌干細(xì)胞在體內(nèi)及體外均具有分化的能力，其子代細(xì)胞應(yīng)呈現(xiàn)分化特征的表型及其相應(yīng)的標(biāo)志，形成新的腫瘤。前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞系經(jīng)特定干細(xì)胞標(biāo)記物分選獲得的癌干細(xì)胞，培養(yǎng)過程中加血清后發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞分化正常干細(xì)胞標(biāo)記Bmil、Oct-3/4、Nanog和 CK14 表達(dá)下降，分化指標(biāo)CK8表達(dá)水平上升，細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)［8］。

1.3 高致瘤性 癌干細(xì)胞的致瘤性因腫瘤種類不同差別較大，主要從兩方面進(jìn)行評價(jià):①癌干細(xì)胞的體外克隆形成能力，即源自原發(fā)性腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系的癌干細(xì)胞在軟瓊脂或基底膜類似物上形成克隆數(shù)及其大小;②癌干細(xì)胞在免疫缺陷動物體內(nèi)的腫瘤形成能力，即將分選的相同數(shù)量的癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞分別原位或異位接種于免疫缺陷動物，觀察其在相同時(shí)間內(nèi)成瘤情況。Tirino等［9］發(fā)現(xiàn)人原發(fā)性骨肉瘤含有CD133+癌干細(xì)胞在體內(nèi)顯示高致瘤性，而且CD133是識別這些細(xì)胞的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.4 耐藥性 耐藥性是癌干細(xì)胞特征之一，癌干細(xì)胞耐藥性的存在導(dǎo)致腫瘤患者化療失敗。癌干細(xì)胞細(xì)胞膜上多數(shù)表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類跨膜蛋白，是多藥耐藥家族中重要的一員，可轉(zhuǎn)運(yùn)肽類、內(nèi)源性脂質(zhì)、核苷酸、代謝性藥物、酶等。Koshiba等［10］發(fā)現(xiàn)ABC蛋白中的ABCG2參與異外源性物質(zhì)新陳代謝的第三階段，被認(rèn)為是代謝物排出的“泵”，而且可以保護(hù)人類身體不受外源性物質(zhì)侵犯。除了ABCG2藥物泵是最主要的耐藥方式，其他耐藥機(jī)制包括癌干細(xì)胞處于靜止期，DNA修復(fù)能力增強(qiáng)，具有抗凋亡作用，受信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控等。

2 癌干細(xì)胞的分選與鑒定

2.1 分選方法 目前主要根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面膜蛋白、黏附分子及受體等的差異，通過流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法分選癌干細(xì)胞，或者用SP細(xì)胞分選法分選純化癌干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分選利用待分選細(xì)胞結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體能力的差異或者利用外排熒光染料性質(zhì)的差異，有無熒光標(biāo)記的細(xì)胞引發(fā)的光電訊號不同，故帶上的電荷不同而被分選［11］。免疫磁珠法分選細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場，無該種表面抗原的細(xì)胞不能與特異性單抗結(jié)合，故不能被磁珠捕獲而無磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離［12］。SP分選法又稱側(cè)群細(xì)胞分選法，該方法可用于表明標(biāo)志物未知的癌干細(xì)胞的分離，即用結(jié)合DNA的熒光染料處理細(xì)胞，用維拉帕米阻斷鈣離子依賴轉(zhuǎn)運(yùn)泵作為對照組，利用癌干細(xì)胞可將染料泵出細(xì)胞的性質(zhì)，將不被Hoechs33342染色或低染色的癌干細(xì)胞篩選出來［13］。

2.2 鑒定方法 細(xì)胞表面特異性標(biāo)志是鑒定癌干細(xì)胞最重要的方法，其他鑒定方法包括溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)法、Hoechst33342染料法、克隆形成能力及異體移植實(shí)驗(yàn)。異體移植實(shí)驗(yàn)是鑒定癌干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)［14］。此外，還有懸浮培養(yǎng)分選假說、抗凋亡分選假說等鑒定方法。

3 癌干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系

癌干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用，其與腫瘤的轉(zhuǎn)移、抗藥性的產(chǎn)生以及治療后的復(fù)發(fā)關(guān)系密切。Huang等［15］從乳腺癌中分離鑒定出一類表型特異的成瘤細(xì)胞(ESA+CD44+CD24-/Low-Lin-)，發(fā)現(xiàn)這類細(xì)胞在NOD/SCID鼠中可持續(xù)地形成腫瘤。癌干細(xì)胞的成功分離不僅證明了腫瘤干細(xì)胞的存在，同時(shí)也找到腫瘤惡變的根源。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，癌干細(xì)胞是完成整個(gè)過程的重要因素。Pang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，具有癌干細(xì)胞特性的 CD133+結(jié)腸癌細(xì)胞中同時(shí)表達(dá) CD133、CD26，并且兩者在原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶表達(dá)一致，同時(shí)也證實(shí)CD133+、CD26+細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲性且在裸鼠體內(nèi)有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。Wright等［17］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中CD44+/CD24－和CD133+亞群細(xì)胞都具有癌干細(xì)胞特征。此外，趨化因子及其受體與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，趨化因子及其受體的檢測可能預(yù)測癌干細(xì)胞是否具有發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性。如同時(shí)表達(dá)CXCR4和CCR7的乳腺癌可能預(yù)示會發(fā)生肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［18］，表達(dá)CXCR4的黑色素瘤與肺和肝轉(zhuǎn)移相關(guān)［19］。

傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物只靶向正在分裂的腫瘤細(xì)胞，不能有效殺滅處于休眠狀態(tài)的癌干細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。目前癌干細(xì)胞靶向治療是腫瘤綜合治療的最有效手段之一，其中包括利用癌干細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志及其抗體與細(xì)胞毒物偶聯(lián)進(jìn)而殺傷癌干細(xì)胞，分離純化癌干細(xì)胞并進(jìn)行致死性輻射后激活其抗宿主癌干細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)，抑制調(diào)控腫瘤生長、增殖的 Wnt、Notch、Hedgehog通路活化。此外，誘導(dǎo)癌干細(xì)胞分化，可以消耗其分裂潛能，從而抑制腫瘤發(fā)展。Yamashita等［20］研究發(fā)現(xiàn)抑瘤素M通過作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，促進(jìn)表皮細(xì)胞黏附因子的肝癌干細(xì)胞分化。Lang等［21］研究發(fā)現(xiàn)以微小RNA(miRNA)在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的特點(diǎn)可以研發(fā)專門針對癌干細(xì)胞的miRNA基礎(chǔ)治療。因此，利用miRNA靶向癌干細(xì)胞可提高抗腫瘤藥物靶向治療作用。惡性腫瘤難以根治的原因之一是癌干細(xì)胞或腫瘤中的側(cè)群細(xì)胞(SP)表達(dá)ABCG2因而形成抗藥性，導(dǎo)致化療效果不理想。因此，有可能通過抑制ABCG2在癌干細(xì)胞中的表達(dá)以除去癌干細(xì)胞從而達(dá)到治愈癌癥的目的。

4 各種癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展

4.1 人類白血病干細(xì)胞 白血病干細(xì)胞是存在于白血病患者體內(nèi)的極少數(shù)具有自我更新和增殖能力并且能夠起始于白血病的細(xì)胞。Bonnet和Dick［22］從急性髓系白血病患者中首次分離 CD34+、CD38－表型的白血病細(xì)胞亞群，真正認(rèn)識到LSC產(chǎn)生白血病的根源。急性髓細(xì)胞性白血病各亞型白血病所得到的白血病干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原的表型都是CD34+/CD38－/CD71－/HLA－DR－/CD90－/CDⅡ7－/CDⅠ23+［23］。通過對白血病干細(xì)胞特異性抗原的研究可以提供白血病干細(xì)胞存在的證據(jù)，以檢測微小殘留病變，并通過白血病干細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原可采取相應(yīng)的靶向治療。

目前研究最多的白血病微環(huán)境中趨化因子CXCL12/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1-和其受體CXCR4間信號通路及黏附分子都會影響白血病干細(xì)胞歸巢和黏附［24-25］。全反式維甲酸治療急性髓細(xì)胞性白血病是誘導(dǎo)分化治療白血病非常有效的治療方法。此外，一些干細(xì)胞自我更新能力的重要調(diào)節(jié)因子和信號通路作為治療的靶點(diǎn)，不僅促進(jìn)白血病干細(xì)胞凋亡還能增強(qiáng)其對化療藥物的敏感性，如抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活性、PI3激酶、抑制細(xì)胞膜酪氨酸激酶 3(Flt3)活性［26-28］。然而，Corbin 等［29］發(fā)現(xiàn)攜帶BCR-ABL融合基因的慢性髓性白血病干細(xì)胞對伊馬替尼治療具有一定的抵抗性。雖然伊馬替尼抑制BCR-ABL活性，但是無法將攜帶有BCR-ABL融合基因的慢性髓性白血病干細(xì)胞徹底消除。

4.2 乳腺癌干細(xì)胞 乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中有極其重要的作用，Honeth等［30］發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24－細(xì)胞在基底樣乳腺癌和BRCA1遺傳性乳腺癌中常見，其中94%遺傳性乳腺癌含有CD44+/CD24－細(xì)胞，可見該群細(xì)胞在乳腺癌的發(fā)生中發(fā)揮著干細(xì)胞樣作用。CD44+CD24－是目前公認(rèn)的乳腺癌標(biāo)志物，還包括CD133+ 、CD133+CXCR4+ 、ALDH-1+ 等［31-32］，但特異性的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物仍未發(fā)現(xiàn)。miRNA異常表達(dá)可以引起癌干細(xì)胞的失調(diào)，導(dǎo)致其不受控制的自我更新和癌演變，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞具有自身特征性 miRNAs。Shimono等［33］研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c-141、miR-200b-200a-429、miR183-96-182這3群miRNAs在乳腺癌干細(xì)胞、人類及小鼠乳腺癌干細(xì)胞及胚胎癌性細(xì)胞中表達(dá)皆有所下調(diào)。

4.3 腦腫瘤干細(xì)胞 Ignatova等［34］將膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于無血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從中分離到具有克隆擴(kuò)增能力、能夠形成神經(jīng)球的腦腫瘤干細(xì)胞。目前腦腫瘤干細(xì)胞鑒定主要依賴其表面標(biāo)志CD133、Nestin蛋白和 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體。Singh等［35］研究發(fā)現(xiàn)0．3%～25．1%的腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下具有增殖與自我更新能力，可形成克隆性的神經(jīng)球樣集落，且這些細(xì)胞都表達(dá)CD133和Nestin蛋白。Liu等［36］證實(shí)CD133+腦腫瘤干細(xì)胞具有化療抵抗性，對CD133+腦腫瘤干細(xì)胞耐藥基因的深入研究進(jìn)一步揭示了腦腫瘤干細(xì)胞的耐藥機(jī)制。另外，通過以 Hedgehog、PTEN/PI3K/Akt、Notch 靶向的治療途徑，為腦腫瘤治療開辟了新的思路。

4.4 胃癌干細(xì)胞 Takaishi等［37］發(fā)現(xiàn)人胃癌細(xì)胞株中可分離出 CD44+和 CD44－細(xì)胞亞群，將CD44+表型細(xì)胞移植入NOD/SCID鼠皮下和胃漿膜下能形成胃癌轉(zhuǎn)移瘤，同時(shí)認(rèn)為CD44是胃癌的癌干細(xì)胞標(biāo)記分子。然而，也有人指出CD44無法作為人類胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物［38］，需進(jìn)一步研究胃癌干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物。目前，Katoh等［39］證實(shí)小分子化合物CXCR4的人類抗體，可靶向聚集于原發(fā)灶以及轉(zhuǎn)移灶的胃癌干細(xì)胞的CXCR4上，為胃癌干細(xì)胞靶向治療提供了新的依據(jù)。Shigdar等［40］從隨機(jī)寡核苷酸庫分離出一個(gè)能與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM結(jié)合的RNA適體，而這種RNA適體內(nèi)部能有效地結(jié)合多種人類腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌、大腸癌和胃癌)表面的EpCAM。癌干細(xì)胞RNA適體將促進(jìn)腫瘤新型靶向治療藥物的發(fā)展。

4.5 肺癌干細(xì)胞 Ho等［41］從人肺癌細(xì)胞系進(jìn)行SP細(xì)胞分選，提出SP細(xì)胞可能是腫瘤細(xì)胞的來源并具有癌干細(xì)胞的特征。Eramo等［42］發(fā)現(xiàn) CD133陽性細(xì)胞和Levina等［43］培養(yǎng)的耐藥存活細(xì)胞均具有肺癌干細(xì)胞的特征，該三類細(xì)胞富集了一定程度的肺癌干細(xì)胞，進(jìn)一步證明了肺癌干細(xì)胞的存在。同時(shí)，更多的研究者提出了醛脫氫酶1(ALDH1)、Oct-4、CD44等作為肺癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志物［44-46］。目前對利用肺癌干細(xì)胞治療肺癌的研究主要集中在信號通路、基因、相關(guān)小分子等方面。肺癌干細(xì)胞相關(guān)信號通路主要有Wnt、Notch、Hedgehog及K-ras途徑及相關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)。另有研究證實(shí)，Rac1在肺癌干細(xì)胞的自我擴(kuò)增中起重要作用，去除Rac1抑制肺癌干細(xì)胞的更新擴(kuò)增能力［47］。Berger等［48］發(fā)現(xiàn)DOK2的缺損可導(dǎo)致小鼠肺癌的發(fā)生，并且DOK可抑制人肺癌細(xì)胞H1299在體外及體內(nèi)的生長，說明DOK2可抑制腫瘤干細(xì)胞的擴(kuò)增。

4.6 前列腺癌干細(xì)胞 目前研究證實(shí)，前列腺癌可能起源于前列腺癌干細(xì)胞，由此可知前列腺癌干細(xì)胞在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用。由于前列腺癌干細(xì)胞發(fā)生異常改變而導(dǎo)致前列腺上皮出現(xiàn)基底細(xì)胞增生、良性前列腺肥大，最終轉(zhuǎn)變成前列腺癌干細(xì)胞［49］。Collins等［50］從前列腺癌細(xì)胞中分離出了細(xì)胞表型為CD44+α2β1hi13±CD133+的細(xì)胞群，雖然這些細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例較少，但它們具有分化成多種細(xì)胞類型和高度表達(dá)增殖的潛能。Patrawala等［51］發(fā)現(xiàn)前列腺癌中表達(dá)CD133、CD44、α2β1-integrin 和(或)CXCR4 的細(xì)胞，而且這些細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。

5 癌干細(xì)胞的臨床應(yīng)用

癌干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生發(fā)展的根源，因此以癌干細(xì)胞特殊靶位點(diǎn)的目的治療為腫瘤治療指明了方向。目前，腫瘤的治療已經(jīng)趨向于只針對癌干細(xì)胞的藥物及治療方法，同時(shí)盡最大可能的保護(hù)正常干細(xì)胞。Gupta等［52］鑒定出了鹽霉素具有抑制小鼠乳腺腫瘤生長以及減弱腫瘤細(xì)胞分化的作用，并能夠?qū)е乱恍┡c乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)缺失，其特異殺傷乳腺癌干細(xì)胞的能力可能約為普通抗癌藥物紫杉醇百倍。也有研究人員逐步開發(fā)研究以小分子抑制劑和融合蛋白為主的靶向癌干細(xì)胞的藥物［53-54］。因此，進(jìn)一步通過確定癌干細(xì)胞的基因圖譜及其特異性靶位，從而高效的殺滅腫瘤細(xì)胞而達(dá)到根治腫瘤的目的，是今后研究工作的新熱點(diǎn)。

6 問題與展望

癌干細(xì)胞是腫瘤治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要因素，所以徹底清除癌干細(xì)胞是根治腫瘤的關(guān)鍵。針對不同癌干細(xì)胞特征，今后癌干細(xì)胞研究需要解決的幾個(gè)關(guān)鍵問題:①某些癌干細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物還未確定;②癌干細(xì)胞起源于正常干細(xì)胞、祖細(xì)胞還是成熟細(xì)胞基因突變;③癌干細(xì)胞純化、鑒定和培養(yǎng)技術(shù)不夠完善;④癌干細(xì)胞基因表達(dá)差異;⑤癌干細(xì)胞耐藥和抗藥機(jī)制;⑥高效靶向治療癌干細(xì)胞又保護(hù)正常干細(xì)胞新方法的研發(fā)。隨著對癌干細(xì)胞研究的深入，癌干細(xì)胞自身疑難點(diǎn)和與腫瘤發(fā)生發(fā)展各項(xiàng)機(jī)制逐步得到全新的認(rèn)識?？傊?，癌干細(xì)胞學(xué)說對于腫瘤診斷、治療、預(yù)后判斷等具有重要意義。

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