谷化平，黃 勇

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinomas，LSCC)是一個(gè)多基因調(diào)控多步驟的過(guò)程，LSCC的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。我們采用免疫組化方法，對(duì)LSCC、不典型增生(AH)、聲帶息肉(VCP)和正常喉黏膜(NLM)組織聯(lián)合檢測(cè)細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)和抑癌基因—磷酸酶基因(PTEN)蛋白表達(dá)，旨在探討這2種基因蛋白表達(dá)與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為預(yù)測(cè)LSCC預(yù)后提供客觀(guān)參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集解放軍251醫(yī)院2002年1月—2012年10月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的LSCC標(biāo)本50例，男40例，女10例;年齡＜60歲11例，≥60歲39例。臨床分期:按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)1997年修訂的 TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期30例。分化程度:高分化癌22例，中/低分化癌28例;有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。取同期癌周AH組織20例，男15例，女5例;年齡 ＜60歲9例，≥60歲11例;VCP組織15例，男12例，女3例;年齡 ＜60歲6例，≥60歲9例，距腫物1 cm以外的NLM組織10例，男8例，女2例;年齡＜60歲2例，≥60歲8例。標(biāo)本經(jīng)40 g/L中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑 鼠抗人Cyclin D1和PTEN單克隆抗體和EnVisionTM試劑盒為福州邁新生物有限公司提供(均為即用型)。

1.3 免疫組化染色方法 采用微波-EnVisionTM(MW-EnVisionTM)兩步法:①石蠟切片脫蠟和水化后，枸櫞酸緩沖液(PBS，10 mmol/L，pH 6．0)沖洗3 min，3次。②微波抗原修復(fù):切片放入PBS液內(nèi)，用微波儀輻射(170 W)5 min，保溫3 min，冷卻后PBS沖洗3 min，3次。③滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物:切片滴加3%過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3 min，3次。④滴加第一抗體，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗3 min，3次。⑤除去PBS液，滴加EnVisionTM試劑(酶標(biāo)記第二抗體)，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3 min，3次。⑥除去PBS液，滴加H2O2-DAB溶液顯色3～5 min。⑦常規(guī)蘇木素復(fù)染、脫水和封片。實(shí)驗(yàn)用已知Cyclin D1和PTEN陽(yáng)性子宮內(nèi)膜癌組織作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替第一抗體作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 Cyclin D1和PTEN在細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽(yáng)性。采用單盲法，每張切片在400倍顯微鏡下選定10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。陰性(－):未見(jiàn)棕黃色顆粒;弱陽(yáng)性(+):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%;陽(yáng)性(++):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25% ～75%;強(qiáng)陽(yáng)性(+++):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，免疫組化指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Cyclin D1和PTEN在喉良、惡性病變中的表達(dá)免疫組化染色顯示，Cyclin D1和PTEN位于細(xì)胞核(圖1、2)。在LSCC中Cyclin D1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于AH、VCP和 NLM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4．20、9．07、9．09，P ＜0．05)，AH 與 VCP 和 NLM 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);在LSCC中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于AH、VCP和NLM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4．22、9．51、5．62，P ＜ 0．05)，AH 與VCP和NLM差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見(jiàn)表1。

2.2 Cyclin D1和PTEN蛋白表達(dá)與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Cyclin D1和PTEN蛋白表達(dá)與LSCC的性別和年齡無(wú)關(guān)(P＞0．05)，隨著LSCC分化程度減低、臨床分期增高和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Cyclin D1表達(dá)陽(yáng)性率顯著增高(P＜0．05)，而PTEN表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低(P＜0．05)，見(jiàn)表2。

表1 細(xì)胞周期素D1和磷酸酶基因蛋白在喉正常及良、惡性病變組織中的表達(dá)

2.3 LSCC中Cyclin D1和PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Cyclin D1陽(yáng)性表達(dá)的31例LSCC中，PTEN表達(dá)陽(yáng)性率為35．5%(11/31);Cyclin D1陰性表達(dá)的19例 LSCC中，PTEN表達(dá)陽(yáng)性率為68．4%(13/19)，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(r= －0．32，P ＜0.05)。

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生的內(nèi)在原因，在細(xì)胞周期中G1→S的調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)經(jīng)過(guò)傳遞、整合匯集到細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，該點(diǎn)調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Cyclin D1基因是一種重要的原癌基因，定位于染色體11q13，表達(dá)產(chǎn)物長(zhǎng)度為120 kb，由295個(gè)氨基酸構(gòu)成，是在細(xì)胞周期中含量呈周期性變化的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在G1期含量最高、活性最大。Cyclin D1在 G1→S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要的正性調(diào)控作用，是與腫瘤有直接關(guān)系的腫瘤基因，其表達(dá)失控可能引起細(xì)胞異常增殖而惡變。已被證實(shí)Cyclin D1基因蛋白在人類(lèi)許多惡性腫瘤中有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，并與預(yù)后有關(guān)［2-8］。本研究結(jié)果顯示Cyclin D1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在LSCC中顯著高于NLM、VCP和AH，且隨著LSCC臨床分期增高、分化程度減低和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其表達(dá)陽(yáng)性率增高，NLM未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，VCP和AH表達(dá)陽(yáng)性率很低，且呈弱陽(yáng)性，表明Cyclin D1基因的改變?cè)贚SCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，檢測(cè)Cyclin D1蛋白表達(dá)可作為判斷LSCC惡性程度、臨床進(jìn)展和生物學(xué)行為的參考指標(biāo)之一。

表2 細(xì)胞周期素D1和磷酸酶基因蛋白表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23上。通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，PTEN與細(xì)胞骨架蛋白和張力蛋白高度同源，提示PTNE可能參與細(xì)胞骨架重組并影響細(xì)胞遷移能力。有研究證實(shí)，PTEN突變或缺失可以促進(jìn)血管內(nèi)皮因子形成，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤微血管形成，從而使腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［8-11］。本研究顯示PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在LSCC中低于NLM、VCP和AH，且隨著LSCC臨床分期增高、分化程度減低和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其表達(dá)陽(yáng)性率降低。提示PTEN的丟失與LSCC的發(fā)生、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中有重要的抑制作用，可能是LSCC的發(fā)生和臨床進(jìn)展過(guò)程中的晚期事件。在臨床病理活檢中檢測(cè)其基因蛋白表達(dá)，可作為早期診斷、預(yù)后判斷和評(píng)價(jià)腫瘤生物學(xué)行為的客觀(guān)參考指標(biāo)，尤其是對(duì)指導(dǎo)臨床采用基因治療提供依據(jù)。

近年來(lái)腫瘤分子生物學(xué)研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅表現(xiàn)為細(xì)胞增殖過(guò)強(qiáng)，而且與細(xì)胞凋亡減弱密切相。本研究結(jié)果顯示，在LSCC中Cyclin D1與PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示在LSCC發(fā)生、發(fā)展、分化和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Cyclin D1和PTEN共同參與了LSCC的演化過(guò)程。因此，聯(lián)合檢測(cè)LSCC組織中Cyclin D1和PTEN蛋白表達(dá)，不僅有助于研究LSCC的發(fā)生發(fā)展，而且對(duì)輔助診斷喉良惡性病變、判斷腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后，也有參考價(jià)值。

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