王永志，余以剛，黃秀麗，肖性龍,*，吳 暉

(1.華南理工大學食品安全與檢測中心，廣東 廣州 510640；2.廣東省惠州市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 惠州 516003)

由食源性微生物導致的疾病一直是食品安全的最大隱患之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年死于飲食被污染的食物或水而引發(fā)的腸胃疾病的人數(shù)高達220萬[1]。全球各國也都投入了大量的人力物力監(jiān)管和控制食源性微生物的傳播和危害。其中，沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌都是重點的監(jiān)控對象。作為腸道致病菌，沙門氏菌和志賀氏菌存在廣泛、危害巨大。沙門氏菌在世界范圍內(nèi)都是最主要的食物和水的污染源之一[2]，而志賀氏菌主要是困擾著發(fā)展中國家，據(jù)統(tǒng)計亞洲每年1000人中平均有2.1個感染者[3]。值得注意的是，這兩種細菌的兒童發(fā)病率都顯著高于成人[3-4]。金黃色葡萄球菌不僅能給污染食品，還對臨床病人的健康造成很大危害。與志賀氏菌類似，金黃色葡萄球菌污染情況在貧困國家更為嚴重[5]。在中國，沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌也對居民健康帶來巨大隱患。一份關(guān)于中國1994—2005年發(fā)生的食源性疾病的報告顯示，超過30%的相關(guān)案例都與這3種細菌有關(guān)，沙門氏菌更是高居首位[6]。為了降低這3種食源性疾病對民眾健康帶來的隱患和政府財政帶來的負擔，一套快速有效的監(jiān)控系統(tǒng)應(yīng)該盡快被建立。

研究人員已經(jīng)提出了多種方法來檢測和監(jiān)控食源性微生物。依賴于基因的檢測方法——PCR以及衍生方法由于其快速、高效獲得了廣泛的應(yīng)用[7]。多重熒光PCR的應(yīng)用更是大大提高了同時檢測多種細菌的效率。一般說來，多重熒光PCR檢測需要一個前增菌的過程，在此過程中如何有效體現(xiàn)特異選擇性，成為當前共增菌培養(yǎng)基研究的熱點之一。至今已有許多關(guān)于選擇性共增菌培養(yǎng)基的研究。俞彩娥[8]研究了沙門氏菌和志賀氏菌共增技術(shù)。

Kim等[9]提出并評估了一種能夠同時增菌培養(yǎng)沙門氏菌、大腸桿菌O157和單增李斯特菌的培養(yǎng)基。本課題組也曾研制了一種能夠同時培養(yǎng)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的共增菌培養(yǎng)基[10]以及一種可用于水產(chǎn)品中沙門氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌前增菌的培養(yǎng)基[11]。

本實驗提出一種能夠同時培養(yǎng)沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)基。在設(shè)計好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加各種促進劑和抑制劑等各種添加劑，通過測定這3種細菌在添加了各種物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長情況并加以進行篩選。確定最終配方之后，再對這個新的共增菌培養(yǎng)基進行初步的評估和驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)(CMCC 47731)、鮑氏志賀氏菌(Shigellosis boydii)(CMCC 51346)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC 41002) 本實驗室保藏；小腸耶爾森氏菌(CMCC 52225)、大腸桿菌O157:H7(ADCPC 931)、綠膿桿菌(CMCC 10211)、副溶血性弧菌(CMCC 20015)、變形桿菌(CMCC 40150)、單增李斯特菌(CMCC 34761)、蠟樣芽孢桿菌(CMCC 70331)等來自東莞出入境檢驗檢疫局饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯、Baird-Parker氏培養(yǎng)基、HE瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、卵增液、多黏菌素B等廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甘氨酸、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、水楊酸、甘露醇、煌綠水、牛膽鹽、疊氮化鈉、萘啶酮酸、亞碲酸鉀等 上海阿拉丁生物科技有限公司；其余試劑皆為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

752S紫外分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；THZ-92C氣浴振動培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)3種細菌的不同特性以及生長的不同條件，考慮簡便性和經(jīng)濟性，選擇沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的共增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分?；A(chǔ)培養(yǎng)基的配方和制作方法為：稱取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2.5g、葡萄糖2.5g、氯化鈉35g加入到1000mL蒸餾水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，滅菌后存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 共增菌培養(yǎng)基中添加成分的篩選

參考之前的研究[10-11]和3種目標菌各自選擇培養(yǎng)基中的特異成分，選擇可能的抑制劑和促進劑進行實驗。甘氨酸、檸檬酸鐵銨、氯化鋰、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、水楊酸、甘露醇、煌綠水、牛膽鹽、疊氮化鈉、萘啶酮酸、乳糖等被列為添加成分，以一定的質(zhì)量濃度加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種后37℃、180r/min培養(yǎng)24h，在600nm波長處測定其光密度(OD)值。確定該共增菌培養(yǎng)基的配方和制作方法。

1.2.3 目標菌在此培養(yǎng)基中的生長評估

已確定的培養(yǎng)基中分別接入一定量的目標菌，使其初始菌濃為103CFU/mL，37℃培養(yǎng)18h。用可見分光光度計測定600nm波長處的OD值。以營養(yǎng)肉湯為空白對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 非目標菌在此培養(yǎng)基中的生長

觀察大腸桿菌O157、單增李斯特菌、小腸耶爾森氏菌、副溶血性弧菌、綠膿桿菌、變形桿菌和蠟樣芽孢桿菌等在此培養(yǎng)基中的生長情況。在制備的培養(yǎng)基中分別接入菌濃為103CFU/mL的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌3種目標菌及雜菌，37℃培養(yǎng)18h。用可見分光光度計測定600nm波長處的OD值。以營養(yǎng)肉湯為空白。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 共增菌各成分的確定

2.1.1 抑制劑的選擇

由表1可知，甘氨酸對志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制強于對沙門氏菌，18g/L質(zhì)量濃度條件下3種細菌幾乎完全不能生長。選擇加入氯化鋰較低劑量時，3種細菌的生長狀況在可接受的范圍之內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定質(zhì)量濃度的檸檬酸鈉對沙門氏菌具有促進作用，對志賀氏菌生長影響較低，卻顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長。硫代硫酸鈉對金黃色葡萄球菌和志賀氏菌抑制強烈，較低的劑量就會完全抑制這兩種菌生長?；途G水對金黃色葡萄球菌的抑制作用要遠遠大于另外兩種菌。疊氮化鈉對3種細菌的抑制作用都非常強烈，而多黏菌素B和萘啶酮酸一樣，只對沙門氏菌和志賀氏菌有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的作用較為溫和。在較低劑量之下，牛膽鹽對3種菌的抑制作用均不強烈。亞碲酸鉀對沙門氏菌和志賀氏菌的抑制作用較低。由于金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生凝固酶且其染色體上存在cysM，亞碲酸鉀的抑制作用便不能發(fā)揮[12]。事實上，含有亞碲酸鉀的瓊脂培養(yǎng)基往往被用來分離金黃色葡萄球菌。實驗也表明，在含有0.3mg/L亞碲酸鉀的培養(yǎng)基中，沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的生長情況良好。

表1 各促進劑和抑制劑對3種細菌生長的影響Table 1 Effect of candidate agent on the growth speed of three bacteria

2.1.2 促進劑的選擇

丙酮酸鈉可為微生物生提供必需的碳源，對3種細菌的作用都比較溫和。卵增液能夠顯著地促進金黃色葡萄球菌的生長，對志賀氏菌有強烈的抑制作用。水楊酸對3種菌都有一定的促進生長作用。與沙門氏菌和志賀氏菌不同的是，金黃色葡萄球菌能夠分解乳糖，故其在含有乳糖的培養(yǎng)基中生長狀況更好。實驗表明，低劑量的甘露醇對3種細菌都具有促進作用，在一定質(zhì)量濃度條件下對鮑氏志賀氏菌的促進作用尤為明顯。

綜合考慮以上添加物質(zhì)對沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌生長情況的作用，以能夠使3種菌同時快速的生長以及對其他雜菌有抑制作用為標準，選擇牛膽鹽、氯化鋰作為抑制劑，選擇甘露醇作為促進劑。

2.1.3 共增菌選擇培養(yǎng)基的制備

稱取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2.5g、葡萄糖2.5g、氯化鈉35g、氯化鋰0.5g、牛膽鹽0.1g、甘露醇2g添加到990mL蒸餾水中，加熱溶解。冷卻至室溫后矯正pH值為7.2。稱取0.3mg亞碲酸鉀溶解入10mL已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液。在無菌條件下，亞碲酸鉀溶液加入原溶液中。所得培養(yǎng)基分裝貯存于4～6℃。命名該培養(yǎng)基為SSS肉湯。

2.2 目標菌在復(fù)合培養(yǎng)基(SSS)中增菌效果的驗證

沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌在SSS肉湯和營養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)中的生長情況分別如圖1～3。沙門氏菌在SSS中生長時，12h就能達到近109CFU/mL的濃度，與在營養(yǎng)肉湯中的生長情況類似，說明在SSS肉湯中沙門氏菌擴增效率高。由于氯化鋰帶來的一定的抑制作用，志賀氏菌在SSS肉湯中的生長速率要慢于在營養(yǎng)肉湯中的速率，可以看出，在SSS肉湯中生長12h后，志賀氏菌菌濃接近105CFU/mL，生長20h時可達108CFU/mL。與營養(yǎng)肉湯相比，金黃色葡萄球菌在SSS肉湯的生長曲線呈現(xiàn)出滯后性，大約需要6h才能進入對數(shù)生長期。12h后金黃色葡萄球菌的菌液濃度可達到106CFU/mL，18h可達109CFU/mL。綜上所述，沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌在SSS肉湯中均能快速生長，18h能分別達到菌液濃度107CFU/mL，能夠滿足后續(xù)檢測的需要。

圖1 沙門氏菌在共增菌培養(yǎng)基肉湯和營養(yǎng)肉湯中的生長情況Fig.1 Growth curve of Salmonella in SSS and nutrient broths

圖2 志賀氏菌在共增菌培養(yǎng)基肉湯和營養(yǎng)肉湯中的生長情況Fig.2 Growth curve of Shigellosis in SSS and nutrient broths

圖3 金黃色葡萄球菌在共增菌培養(yǎng)基肉湯和營養(yǎng)肉湯中的生長情況Fig.3 Growth curve of Staphylococcus aureus in SSS and nutrient broths

2.3 非目標菌在SSS肉湯中的生長情況

表2 目標菌和非目標菌在SSS肉湯中的生長情況Table 2 Growth speed of target and non-target bacteria in SSS broth

以營養(yǎng)肉湯作對照，其他的食源性致病菌在SSS肉湯中的生長情況也被測定。由表2可知，目標菌株沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌在該復(fù)合增菌肉湯中均能快速生長，18h培養(yǎng)情況下的生長情況能夠滿足檢測的要求。非目標菌株大腸桿菌O157、蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌、變形桿菌、副溶血性弧菌和綠膿桿菌的生長則受到抑制。其中蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌和綠膿桿菌完全不能生長，大腸桿菌O157、副溶血性弧菌和綠膿桿菌生長受到抑制，18h生長后菌液濃度低，不會對目標菌的檢測等造成干擾。

3 討 論

當前的食品安全問題愈演愈烈，引起社會和媒體的極大關(guān)注，也給相關(guān)監(jiān)管部門帶來了巨大的壓力。單平臺、高通量、高效率是給食源性致病菌檢測提出的新挑戰(zhàn)，也推動了一系列相關(guān)新技術(shù)的發(fā)展，如多重PCR[13]、多重熒光PCR技術(shù)[14]、DNA微陣列雜交技術(shù)[15]、免疫微陣列技術(shù)[16]等。

本實驗討論了一種能夠同時富集沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的共增菌培養(yǎng)基。應(yīng)用SSS肉湯可以對可能含有多個菌株污染的樣品進行增菌檢測。該培養(yǎng)基除含有微生物生長必需的碳源、氮源等外，還有牛膽鹽、氯化鋰、亞碲酸鉀等，可以有效對除沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌之外的非目標菌進行抑制[17]。研究顯示，氯化鋰對單增李斯特菌具有較強烈的抑制作用[18]，而牛膽鹽可以抑制革蘭氏陽性菌的生長。亞碲酸鉀對霍亂弧菌、腸桿菌的生長有著廣泛的抑菌作用[11,19]，較高濃度的氯化鈉也可以帶來一定的抑菌作用[20]，從而有效保證了SSS肉湯的選擇性。

本實驗表明在應(yīng)用SSS肉湯的情況下，初始濃度為103CFU/mL的3種細菌在培養(yǎng)18h之后濃度可達107CFU/mL，可以滿足PCR檢測限的要求。非目標菌株在此培養(yǎng)基中的生長受到抑制，表現(xiàn)為完全不生長或者生長活性低。常規(guī)的PCR檢測前增菌包括兩個過程，一是所有可能污染微生物的增菌過程，然后再有相應(yīng)的選擇性增菌過程。SSS肉湯的應(yīng)用可以合并兩個過程為一，增菌后能夠直接應(yīng)用于后續(xù)的檢測中，提高了檢測效率。

今后的研究可以深入探討各種抑制劑的抑菌機理和3種目標菌同時存在的生長情況，并研究SSS肉湯對壓力損傷細菌和酸損傷細菌的恢復(fù)能力。通過人工污染的方法進行實際樣品的檢驗，探討如何消除培養(yǎng)基的存在對檢測結(jié)果的影響。

[1]World Health Organization.WHO fact sheet N.237: Food safety and foodborne illness[EB/OL].(2007-08-08) [2012-04-30].http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs237/en/index.html.

[2]TODD E C.Epidemiology of foodborne diseases: a worldwide review[J].World Health Statistics Quarterly, 1997, 50(1/2): 30-50.

[3]von SEIDLEIN L, KIM D R, ALI M, et al.A multicentre study ofShigella diarrhoeain six Asian countries: disease burden, clinical manifestations, and microbiology[J].PLoS Medicine, 2006, 3(9):e353.

[4]United States Department of Agriculture.Report to Congress 1998.FoodNet: an active surveillance system for bacterial foodborne diseases in the United States[EB/OL].(2008-06-02) [2012-04-30].http://www.fsis.usda.gov/ophs/ rpcong98/rpcong98.html.

[5]World Health Organization.Assuring food safety and quality:WHO and FAO[EB/OL].(2006) [2012-04-30].http://www.who.int/publications/list/guidelines_food_control/zh/.

[6]WANG S J, DUAN H L, ZHANG W, et al.Analysis of bacterial foodborne disease outbreaks in China between 1994 and 2005[J].FEMS Immunology & Medical Microbiology, 2007, 51(1): 8-13.

[7]DE-DIN.ISO 20838—2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs - polymerase chain reaction (PCR) for the detection of foodborne pathogens - Requirements for amplification and detection for qualitative methods.

[8]俞彩娥.沙門菌和志賀菌通用增菌液增菌效果實驗觀察[J].預(yù)防醫(yī)學情報雜志, 2006, 22(3): 369-370.

[9]KIM H, BHUNIA A K.A SEL, a selective enrichment broth for simultaneous growth ofSalmonella enterica,Escherichia coliO157:H7, andListeria monocytogenes[J].Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(15): 4853-4866.

[10]YU Yigang, WU Hui, LIU Yuanyuan, et al.A multipathogen selective enrichment broth for simultaneous growth ofSalmonellaentericaserovar Enteritidis,Staphylococcus aureus, andListeria monocytogenes[J].Canadian J Microbiol, 2010, 56(7): 585-597.

[11]XIAO Xinglong, LI Yijuan, QIN Yiying, et al.A multipathogen selective enrichment broth for simultaneous growth ofSalmonellaspp.,Vibrio parahaemolyticus, andVibrio cholerae[J].J General and Applied Microbiology, 2010, 56(6): 465-474.

[12]龐慧, 葉長蕓, 徐建國.一些細菌的亞碲酸鉀抗性[J].疾病監(jiān)測,2007, 22(5): 350-352.

[13]XU Y G, CUI L C, TIAN C Y, et al.A multiplex polymerase chain reaction coupled with high-performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogens[J].Food Control, 2012, 25: 778-783.

[14]OSCAR fD, PALMIRO P, SANTO M, et al.A filtration-based realtime PCR method for the quantitative detection of viableSalmonella entericaandListeria monocytogenesin food samples[J].Food Microbiology, 2009, 26: 311-316.

[15]CHIANG Y C, YANG C Y, LI C, et al.Identification ofBacillusspp.,Escherichia coli,Salmonellaspp.,Staphylococcusspp.andVibriospp.with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization[J].Int Food Microbiol, 2006, 107: 131-137.

[16]CHEN C S, DURST R A.Simultaneous detection ofEscherichia coliO157:H7,Salmonellaspp.andListeria monocytogeneswith an arraybased immunosorbent assay using universal protein G-liposomal nanovesicles[J].Talanta, 2006, 69: 232-238.

[17]JACOBSEN C N.The influence of commonly used selective agents on the growth ofListeria monocytogenes[J].International Journal of Food Microbiology, 1999, 50: 221-226.

[18]TAORMINA P.Comparison of growth of a combined strainListeria monocytogeneschallenge study inoculum in different chloride salt solutions[C]//Sabin St: International Association for Food Protection, 2012.

[19]朱敏, 梅玲玲, 程蘇云.改良李斯特菌增菌液的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007, 17(2): 293-295.

[20]孫之南, 王娟, 魯梅芳, 等.氯化鈉對幾種常見菌的抑制作用[J].鹽業(yè)與化工, 2006, 36(1): 12-15.