葛曙光

山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030000

隨著科技的發(fā)展以及人類對于基因的研究深入，生命科學(xué)已經(jīng)進入一個后基因組學(xué)的時代。其中蛋白質(zhì)組學(xué)是其中一個后基因組學(xué)時代的一個研究熱點。蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究生物體或者細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成以及其相應(yīng)規(guī)律的科學(xué)。主要是通過對樣品進行前處理后，對樣品中的蛋白質(zhì)以及多胎碎片進行分離以及鑒定，同時對比數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)從而得到相應(yīng)的生物信息。這對于病因不明確的疾病，了解其致病發(fā)病的機理以及治療途徑等均有著顯著的積極影響。骨關(guān)節(jié)炎癥是一種慢性疾病，對于患者的日常生活質(zhì)量影響較大。目前臨床上對于骨關(guān)節(jié)炎的治療仍未有治療效果較為滿意的手段。通過了解骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理，針對性提出相應(yīng)的治療方案，使得骨關(guān)節(jié)炎能夠得到更好的治療，取得滿意的臨床效果[1]。該文主要是對蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用在骨關(guān)節(jié)炎中進行研究討論。

1 蛋白組學(xué)技術(shù)

蛋白組學(xué)技術(shù)研究主要是圍繞兩種蛋白組學(xué)進行研究探討。一種是表達蛋白質(zhì)組學(xué)，這主要是應(yīng)用在生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究；另一種是功能蛋白質(zhì)組學(xué)，主要是研究與疾病有關(guān)的患者出現(xiàn)個體差異的表達蛋白質(zhì)。對于臨床上研究，主要針對功能蛋白質(zhì)組學(xué)進行一系列相關(guān)的研究。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)主要是針對以下幾個方法進行探討，其中包括疾病模型蛋白質(zhì)組學(xué)研究、疾病生物標(biāo)記物的研究、藥物蛋白質(zhì)靶向藥物的研究。低豐度蛋白質(zhì)在人體生命活動調(diào)節(jié)中起著重要的作用，因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點以及研究的難點主要是對低豐度蛋白質(zhì)的分離以及鑒別。目前對于低豐度蛋白質(zhì)的研究測定主要是通過兩種分析技術(shù)進行分析研究，最常用的是雙電泳技術(shù)以及質(zhì)譜分析技術(shù)。這兩種技術(shù)共同特點是能夠分離樣品中的雜質(zhì)同時能夠定量測定樣品中目標(biāo)物質(zhì)的含量。由于蛋白質(zhì)的分子相對較大，而且較容易變形，因此對于蛋白質(zhì)的研究，樣品的前處理是相對較為關(guān)鍵的步驟[2]。雙電泳技術(shù)主要是通過凝膠電泳將蛋白質(zhì)進行高效的分離后，得到轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，然后通過數(shù)據(jù)的查詢對比，以及根據(jù)測定樣品的等電位點以及分子量等信息，分析樣品的生物活性以及根據(jù)斑塊的大小等進行定量分析。而質(zhì)譜技術(shù)主要是對樣品進行離子化，對蛋白質(zhì)樣品進行蛋白質(zhì)的分子量以及氨基酸序列的分析。質(zhì)譜技術(shù)屬于半定量的分析方法，可以串聯(lián)其他技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)一起進行分析定量鑒別使用。

2 骨關(guān)節(jié)蛋白組學(xué)研究

人體關(guān)節(jié)中一般包括有三大標(biāo)本部分，分別是軟骨標(biāo)本、關(guān)節(jié)液標(biāo)本以及滑膜標(biāo)本。不同的標(biāo)本類型有著不同的處理方法。在蛋白組學(xué)中樣品的前處理是整個研究過程中較為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。以下將對各種不同關(guān)節(jié)類型的樣品的前處理進行分析討論。

2.1 軟骨關(guān)節(jié)前處理

其中軟骨標(biāo)本包括軟骨細胞以及軟骨蛋白組學(xué)的研究。其中軟骨細胞分離主要是在胰蛋白酶或者膠原酶在接近人體體溫37℃進行軟骨細胞的分離，然后在DMEM以及10%的FCS的條件下進行軟骨細胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)后需要手機軟骨細胞進行原代培養(yǎng)，主要是利于胰蛋白酶的消化作用進行收集以及培養(yǎng)。然后在采用尿酸溶解緩沖液提取蛋白質(zhì)，即可完成前處理。而軟骨蛋白質(zhì)組學(xué)的研究則主要是在-80℃的條件下進行粉碎，然后在NaCL以及HEPES的緩沖液中進行蛋白質(zhì)的提取，采用CPC沉淀的方法將聚集蛋白聚糖去除，然后進行蛋白質(zhì)的沉淀，經(jīng)過DOC以及TCA的樣本洗滌后，在尿酸溶解緩沖液中溶解，然后進行軟骨的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[3]。

一般對于關(guān)節(jié)炎病理的研究主要是采用動物模型。一般采用小鼠作為實驗動物，這是由于小鼠的個體差異較少，并且其對照較好，因此主要應(yīng)用在骨關(guān)節(jié)炎的研究中。目前一些研究已經(jīng)在病理狀態(tài)下以及正常狀態(tài)下找到兩者蛋白質(zhì)的差異，對于發(fā)病機制等仍需要進一步研究探索。

2.2 關(guān)節(jié)液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

對于關(guān)節(jié)液的前處理，主要有以下幾步。采集關(guān)節(jié)液的標(biāo)本后，需要采用親和力較強的色譜進行白蛋白以及IgG的去除。然后采用DOC/TCA對樣本進行洗滌沉淀蛋白后將樣品溶解在尿素溶解緩沖液中，將蛋白質(zhì)溶解，即可進行關(guān)節(jié)液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

關(guān)節(jié)液主要是在骨關(guān)節(jié)中起到潤滑的作用，關(guān)節(jié)液中含有部分從軟骨關(guān)節(jié)中釋放的蛋白質(zhì)。這部分蛋白質(zhì)會隨著關(guān)節(jié)液和血液之間的交換將部分的軟骨細胞以及基質(zhì)帶到血液中。因此對于關(guān)節(jié)液的研究，還可以從血漿中進行。目前已經(jīng)有研究證實[9]在關(guān)節(jié)液以及血液中能夠發(fā)現(xiàn)部分的關(guān)節(jié)炎癥的標(biāo)記物。這對于靶向藥物的開發(fā)等有著重要的提示意義。一旦骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)記物能在血液中被鑒定，能提高骨關(guān)節(jié)炎的診斷的速度以及準(zhǔn)確率。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對于骨關(guān)節(jié)炎癥的診斷也有一定的積極意義。

2.3 滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

滑膜同樣也分為滑膜細胞以及滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究。其中滑膜細胞的研究需要在胰蛋白酶的作用下，在37℃的反應(yīng)條件下進行滑膜細胞的分離，然后在RPMI以及10%的FCS的條件下進行軟骨細胞的培養(yǎng)，然后在胰蛋白酶的消化下進行軟骨細胞的收集以及原代培養(yǎng)，然后在尿素溶解緩沖溶液中進行蛋白質(zhì)的提取，即可進行滑膜細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[5]。而對于滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究則主要是在-80℃的條件下進行粉碎，然后在飛例子裂解緩沖液中進行蛋白質(zhì)的提取，然后采用DOC/TCA對樣本進行洗滌將蛋白質(zhì)進行沉淀，然后在尿素溶解緩沖液中將蛋白質(zhì)進行溶解，隨即可開始滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[6]。

3 骨關(guān)節(jié)炎炎癥細胞的研究

臨床上已經(jīng)證實，前炎性細胞因子，腫瘤壞死因子是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要的炎癥致病因子。蛋白組組學(xué)的其中一種技術(shù)是將這些導(dǎo)致發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的因子對軟骨細胞進行刺激以及移植，觀察軟骨發(fā)病以及退變的過程，這對于研究軟骨發(fā)病以及退變的機制研究有著重要的意義。同時在小鼠的軟骨移植物種出現(xiàn)有類似的組織生長因子碎片。在動物骨關(guān)節(jié)炎模型中，可以觀察到組織生產(chǎn)因子在骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎軟骨以及關(guān)節(jié)液的表達中會受到一定的反饋性調(diào)劑。

4 討論

由于人體組成含有大量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，并且在骨關(guān)節(jié)炎的研究中取得相應(yīng)的成效，對于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制以及相應(yīng)的治療手段仍處于初步的研究開發(fā)階段。目前主要是以發(fā)現(xiàn)差異蛋白為主。另外對于蛋白質(zhì)組學(xué)在骨關(guān)節(jié)炎的研究分析手段、研究方法以及數(shù)據(jù)處理等方面仍需要進一步的發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)為日后骨關(guān)節(jié)炎研究、骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制以及值得相應(yīng)的藥物和治療方案中均具有積極重大的意義。

[1]安丙辰，戴尅戎.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用[J].國際骨科學(xué)雜志,2010(4):197-199.

[2]黃玉佳.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2011(21)：135-136.

[3]梁清華，蔣勇前，熊新貴，等.痹腫消湯干預(yù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010（11）：1160-1164.

[4]萬春友，馮強，張福江，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2011（3）：185-189.

[5]王建光.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2011.

[6]謝秀麗，劉健，萬磊，等.活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎蛋白質(zhì)代謝變化及相關(guān)性分析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010(5)：982-985.