張 帆， 李敏康， 宋宏新

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

低聚木糖(Xylooligosaccharides，簡(jiǎn)稱XOs)是一類功能性低聚糖，是木聚糖的降解產(chǎn)物，由2～7個(gè)木糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的聚合性糖，此外還含有阿拉伯糖醛酸、葡萄糖醛酸側(cè)鏈[1].低聚木糖主要以木二糖和木三糖為有效成分[2].因其具有調(diào)節(jié)腸道功能，促進(jìn)雙歧桿菌增殖、低熱量、防齲齒、促進(jìn)鈣的吸收、無(wú)毒安全性、抗炎、抗疲勞、降血壓、血糖、血脂和膽固醇等生理功能，近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn).

在固態(tài)發(fā)酵中，底物(基質(zhì))是不溶于水的聚合物，不僅可以提供微生物生長(zhǎng)所需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水分以及其他營(yíng)養(yǎng)物，更是微生物生長(zhǎng)的載體[3].小麥麩皮除蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)含量較高外，含有大量碳水化合物[4].它既是碳源，又是氮源，還含有某些對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能起促進(jìn)作用的因子[5]，故可作為固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)微生物.小麥麩皮中的碳水化合物多為細(xì)胞壁多糖，主要由阿拉伯木糖、纖維素、葡聚糖等組成，其中阿拉伯木聚糖為主要成分[6,7]，約為小麥麩皮非淀粉多糖的70%[8]，可由酶法降解為低聚木糖.

本文對(duì)比了微生物以麥麩為發(fā)酵基質(zhì)通過(guò)固態(tài)發(fā)酵制備低聚木糖與商品酶制劑制備低聚木糖等兩種制備方法的差異，探討了微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖的可行性，為小麥麩皮的綜合利用以及低聚木糖的制備提供了新途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及菌種

麥麩，市售；木霉(Trichodermasp.)，陜西科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種.

1.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：3,5-二硝基水楊酸、薄層層析硅膠GF254、吐溫-20為化學(xué)純；木聚糖酶、95%低聚木糖、D-木糖為生化試劑；苯胺、二苯胺、正丁醇、吡啶等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

主要儀器：MJ-250B型霉菌培養(yǎng)箱，上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；SYQ.DSX-280型手提式壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖

以木霉為實(shí)驗(yàn)菌種，麥麩為唯一發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在木霉生長(zhǎng)期誘導(dǎo)產(chǎn)生木聚糖酶降解麥麩以制備低聚木糖，其工藝流程如圖1所示.

圖1 微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖工藝流程

固態(tài)發(fā)酵液的制備：稱取10 g麥麩于250 mL三角瓶后，依次加入10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，以1%接種量接入濃度為107個(gè)·mL-1的孢子懸液，攪拌后于28 ℃恒溫培養(yǎng)84 h.固態(tài)發(fā)酵完成后，向三角瓶中加入10倍蒸餾水，于37 ℃恒溫水浴搖床以135 r·min-1振蕩浸提1 h，5 000 r·min-1、4 ℃離心20 min，去除孢子和固形物，經(jīng)無(wú)菌濾紙過(guò)濾，所得發(fā)酵液備用.

測(cè)定固態(tài)發(fā)酵液的可溶性總糖含量、還原糖含量，計(jì)算低聚木糖平均聚合度及低聚木糖的含量，并對(duì)固態(tài)發(fā)酵液薄層層析分析其組成成分.

以木霉為實(shí)驗(yàn)菌種，麥麩為唯一發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，考察了起始pH、起始含水量、接種量、吐溫-20添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、低聚木糖添加量等幾個(gè)單因素對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響[9]，并在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上選定培養(yǎng)溫度為28 ℃培養(yǎng)60 h后轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵總時(shí)間84 h，低聚木糖的添加量為0.25%，設(shè)計(jì)起始pH、起始含水量、接種量、吐溫-20添加量四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平表如表1所示.

表1 因素水平表

1.2.2 商品木聚糖酶酶解麥麩木聚糖制備低聚木糖

以堿法粗提木聚糖[10]為底物，通過(guò)商品木聚糖酶對(duì)其降解制備低聚木糖，其工藝流程如圖2所示.

圖2 商品酶酶解麥麩木聚糖制備低聚木糖工藝流程

酶解液的制備：稱取2 g粗提木聚糖、0.428 0 g木聚糖酶于100 mL三角瓶中，加入pH6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液40 mL，將三角瓶于36 ℃水浴搖床，以135 r·min-1振蕩反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后立即于沸水浴中滅酶，于4 ℃下5 000 r·min-1離心20 min，去除固形物，上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾備用.

測(cè)定酶解液中的可溶性總糖濃度、還原糖濃度，計(jì)算低聚木糖平均聚合度和酶解液中的低聚木糖含量，對(duì)酶解液薄層層析分析其組成成分.

1.2.3 分析方法

(1)還原糖(按木糖計(jì))的測(cè)定：

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]，540 nm下吸光度值(Y)與木糖含量(X)的回歸方程為：Y=0.822 7X+0.015 5，R2=0.996 8.

(2)可溶性總糖的測(cè)定：

取1 mL發(fā)酵液或酶解液，加入3 mL濃度為6 mol·L-1的鹽酸，沸水浴處理2 h，冷卻后以6 mol·L-1氫氧化鈉中和至中性，定容至10 mL，稀釋適當(dāng)倍數(shù)按DNS法測(cè)定.

(3)低聚木糖含量的計(jì)算：

低聚木糖含量=可溶性總糖含量-還原糖含量.

(4)低聚木糖平均聚合度[11]的計(jì)算：

平均聚合度=可溶性總糖濃度/還原糖濃度.

低聚木糖平均聚合度表示由木糖為基本單元聚合而成的低聚木糖所含木糖數(shù)目的平均值，可以用于衡量低聚木糖的主要組成成分種類.

(5)硅膠薄層層析：

展開(kāi)劑：V(正丁醇)∶V(吡啶)∶V(蒸餾水)=6∶4∶3；顯色劑：苯胺-二苯胺試劑.

(6)麥麩木聚糖降解率：

木聚糖在木聚糖酶的作用下降解成低聚木糖，低聚木糖的生成量與麥麩木聚糖含量的比值為麥麩木聚糖降解率，可衡量木聚糖酶對(duì)木聚糖的降解程度.

2 結(jié)果與討論

2.1 木霉固態(tài)發(fā)酵麥麩的最佳工藝確定

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

由表2得出各因素的主次順序?yàn)锽>D>A>C，制備低聚木糖的最佳條件組合為B2D2A3C3，即起始含水量10 mL、吐溫-20添加量0.05%、起始pH5.0、木霉接種量1.5%.

在正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)條件下，固態(tài)發(fā)酵液中可溶性總糖含量為198.62 mg·g-1，還原糖含量為49.32 mg·g-1，低聚木糖含量為149.3 mg·g-1，平均聚合度為4.027，麥麩木聚糖降解率為66.21%.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 兩種生物酶法的比較

2.2.1 工藝比較

兩種方法(見(jiàn)圖1和圖2)均是利用酶法催化降解麥麩木聚糖來(lái)制備低聚木糖，前者以培養(yǎng)產(chǎn)酶微生物為出發(fā)點(diǎn)，麥麩既作為微生物培養(yǎng)的基料、在微生物生長(zhǎng)期誘導(dǎo)其產(chǎn)木聚糖酶，同時(shí)又作為微生物所產(chǎn)木聚糖酶的酶解底物；而后者直接以商品酶制劑參與酶解過(guò)程制備低聚木糖.

傳統(tǒng)酶法工藝中一般分為木聚糖酶的產(chǎn)生、提取精制和酶解木聚糖三個(gè)過(guò)程，而微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩的方法省略了木聚糖酶的提取精制過(guò)程，使微生物產(chǎn)木聚糖酶和酶解麥麩木聚糖兩個(gè)過(guò)程在同一體系中進(jìn)行，只需在麥麩上接種產(chǎn)木聚糖酶微生物，通過(guò)調(diào)控固態(tài)發(fā)酵條件培養(yǎng)84 h，便可制得低聚木糖，節(jié)省了提取精制木聚糖酶的時(shí)間和費(fèi)用，簡(jiǎn)化了低聚木糖的制備工藝.

傳統(tǒng)酶法酶解溫度一般恒定，而固態(tài)發(fā)酵前期溫度以保證微生物生長(zhǎng)產(chǎn)酶，發(fā)酵后期溫度由28 ℃升高至37 ℃，既考慮了微生物的生長(zhǎng)需要，又兼顧木聚糖酶酶解要求，從而有效地保證兩個(gè)過(guò)程在同一體系中進(jìn)行.

麥麩中除含有大量非淀粉多糖外，還含有淀粉、蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)的存在會(huì)影響木聚糖酶的作用效果，同時(shí)增加了后續(xù)低聚木糖分離純化的難度.傳統(tǒng)酶法一般先要利用淀粉酶和蛋白酶將其去除再酶解，而固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中無(wú)需去除淀粉及蛋白質(zhì)而可被微生物生長(zhǎng)利用，簡(jiǎn)化麥麩預(yù)處理工藝.

綜上，兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較，如表3所示.

表3 兩種酶法優(yōu)缺點(diǎn)比較

2.2.2 結(jié)果比較

以固態(tài)發(fā)酵液及酶解液中的還原糖濃度、可溶性總糖濃度、低聚木糖的平均聚合度、低聚木糖含量、麥麩木聚糖降解率為指標(biāo)，結(jié)合薄層層析對(duì)兩種生物酶法制備低聚木糖的效果加以比較.成分分析比較如表4所示.薄層層析結(jié)果如圖3所示.

表4 固態(tài)發(fā)酵液及酶解液的分析比較

由表3可知，微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩所得低聚木糖的含量為149.3 mg·g-1，平均聚合度偏高為4.027，麥麩木聚糖降解率可達(dá)66.21%.薄層層析結(jié)果顯示，固態(tài)發(fā)酵液中低聚木糖的主要成分為木三糖，而幾乎不含木糖和木二糖.說(shuō)明在固態(tài)發(fā)酵體系中產(chǎn)生的木糖和木二糖可被微生物利用，進(jìn)而繼續(xù)參與發(fā)酵過(guò)程，從而未能有效積累.

a:1%低聚木糖(1.木二糖 2.木三糖 3.木四糖); b:1%D-木糖; c:1%葡萄糖; d:固態(tài)發(fā)酵液; e:酶解液圖3 固態(tài)發(fā)酵液及酶解液薄層層析

而商品木聚糖酶酶解粗提木聚糖所得酶解液中，低聚木糖的含量為107.38 mg·g-1，低聚木糖平均聚合度為2.148，酶解液中低聚木糖的主要成分為木二糖、木三糖，幾乎不含木糖.說(shuō)明商品木聚糖酶具有較好的作用效果，充分體現(xiàn)了其內(nèi)切特性，通過(guò)酶解工藝的優(yōu)化，能夠較好地控制酶解進(jìn)程，麥麩木聚糖降解率為66.97%.

固態(tài)發(fā)酵液與酶解液中的可溶性總糖含量相當(dāng)，說(shuō)明微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩與商品酶制劑的酶解效果相當(dāng)，微生物所產(chǎn)木聚糖酶適合于酶解麥麩，但還原糖含量卻明顯低于酶解液中還原糖含量，可能是由于發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖供微生物生長(zhǎng)利用所致.前者平均聚合度偏高，其低聚木糖的組成成分主要為木三糖、木四糖；而后者所得低聚木糖的主要成分為木二糖、木三糖，有效成分較多，制得低聚木糖的質(zhì)量更高.說(shuō)明固態(tài)發(fā)酵過(guò)程對(duì)于木二糖含量的積累有一定影響，但其制備低聚木糖中含有木三糖、木四糖，證明了該法的可行性.

3 結(jié)論

以微生物固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖的有效成分主要為木三糖、木四糖，雖然沒(méi)有商品木聚糖酶所制備低聚木糖有效成分種類多，但由微生物經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的木聚糖酶對(duì)木聚糖具有一定酶解效果，麥麩木聚糖降解率可達(dá)66.21%，能夠?qū)崿F(xiàn)微生物以麥麩為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)生長(zhǎng)，并在生長(zhǎng)期誘導(dǎo)所產(chǎn)木聚糖酶降解麥麩同步進(jìn)行，簡(jiǎn)化了低聚木糖制備工藝，方法具有可行性，同時(shí)麥麩既作為微生物生長(zhǎng)的基料又作為木聚糖酶的作用底物，使麥麩得以充分利用，增加了麥麩的附加值，為麥麩的綜合利用及低聚木糖的制備探索出了一條新途徑.

但其在發(fā)酵過(guò)程中，木二糖可被微生物再次利用而未能得以積累導(dǎo)致有效成分偏低，同時(shí)由于體系復(fù)雜，在后續(xù)分離純化過(guò)程中也增加了分離低聚木糖的難度.在不同發(fā)酵階段，還應(yīng)考慮微生物生長(zhǎng)、產(chǎn)酶、酶解條件的區(qū)分與協(xié)調(diào)，從而達(dá)到提高終產(chǎn)物低聚木糖產(chǎn)量的目的.因此，應(yīng)該對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中如何提高低聚木糖有效成分，以及降低低聚木糖分離純化難度方面展開(kāi)進(jìn)一步研究.

[1] Kyoji Y，Naoki H，Kunimasa K，et al.Inhibitory effects of acidic xylooligosaccharide on stree-induced gastric inflammation in mice[J].Food Hyg Soc Japan，2006，47(6)：284-287.

[2] Carole A，Stephane P，Valerie L P，et al.Wheat bran tissue fractionation using biochemical markers[J].Journal of Cereal Science，2004，39(3)：387-393.

[3] 徐福建，陳洪章，李佐虎.固態(tài)發(fā)酵工程研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，2002，22(1)：44-47.

[4] Pandey A，Benjamin A，Soccol C R，et al.The realm of microbial lipases in biotechnology[J].Appl Biochem Biotechnol,1999,29(2):119-131.

[5] 林 琳.小麥麩皮的營(yíng)養(yǎng)成分及其開(kāi)發(fā)利用[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2010，(3)：41-42.

[6] Maes C，Delcour A.Structural characterization of water-extractable and water-unextractable arabinoylans in wheat bran[J].Cereal Sci，2002，35(3)：315-326.

[7] Beldmna G，Osuga D，Whitaker J R.Some characteristics ofβ-D-xylopyrano-sidases，α-L-arabinofuranosidases and an arabinoxylanα-L-arabinofuranohydrolase from wheat bran and germinated wheat[J].Journal of Cereal Science，1996，23(2)：169-180.

[8] Plessi M，Bertelli D，Monzani A，et al.Dietary fiber and some elements in nuts and wheat brans[J].Journal of Food Composition and Analysis，1999，12(2)：91-96.

[9] 李敏康，張 帆，宋宏新.木霉固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖的初步研究[J].中國(guó)釀造，2012，31(12)：60-63.

[10] 韓玉潔，徐 冬，徐 忠，等.小麥麩皮中低聚木糖底物—半纖維素提取條件的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(1)：44-47.

[11] 楊書艷,徐春梅,鄔敏辰.用玉米芯酸酶法制備低聚木糖的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(12)：3 651-3 653.