張志博 ，李安文，李勤 ，肖文軍，3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院植物資源工程系，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院茶學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410128）

越橘，果實(shí)為藍(lán)色或紅色漿果，杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木[1]。越橘花色苷作為天然植物色素，具有良好的生物活性以及抗氧化、抗炎抗癌、降血脂、保護(hù)視力的生理功能[2-9]，在臨床藥用以及保健食品開(kāi)發(fā)方面均具有廣泛的應(yīng)用前景[10]。但是，由于越橘花色苷特殊的C6-C3-C6碳骨架特征結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性較差[11]，限制了越橘花色苷在加工和貯藏過(guò)程中的應(yīng)用范圍。目前對(duì)于越橘花色苷的研究多集中于提取檢測(cè)、分離純化及藥理作用等方面[12-13]，而對(duì)其穩(wěn)定性缺少系統(tǒng)的研究[14-18]。本文以越橘濃縮汁為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)系統(tǒng)考察了不同pH 條件、溫度、時(shí)間、離子種類(lèi)和氧化劑等因子對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響，以期為越橘花色苷加工和貯藏提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料

越橘濃縮果汁：黑龍江尚志綠野漿果有限公司，百粒糖度（65±2）°，花色苷含量3.25 mg/g。

1.1.2 儀器與試劑

Lab Tech 可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司；EASY pureⅡ純水儀、SK3300LH 超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；pH 計(jì)、FA2104S 電子分析天平：上海精科天平廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：鞏義市英峪儀器廠；氯化鈉、二氯化錫、氯化銅、氯化鐵、氯化鉀、濃鹽酸、乙酸鈉、乙酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)；矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：上海永恒生物科技有限公司，純度98.5%。

1.2 方法

1.2.1 越橘花色苷含量檢測(cè)

取越橘濃縮果汁稀釋到一定濃度，全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。采用pH 示差法[19]以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣對(duì)越橘花色苷的吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算得其含量。

1.2.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取越橘濃縮果汁稀釋加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品，在520 nm 和700 nm 下檢測(cè)吸光度值，計(jì)算越橘花色苷含量。

1.2.3 pH 對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液將越橘濃縮汁配制成pH 分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的溶液，室溫放置3 h，取樣檢測(cè)其吸光度，計(jì)算越橘花色苷含量。

1.2.4 溫度對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，分別于4、25、40 ℃條件下放置4.0 h，測(cè)定其吸光度，計(jì)算越橘花色苷含量。

1.2.5 時(shí)間對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，室溫下放置7 h，每隔1 h 取樣測(cè)定其吸光度，計(jì)算越橘花色苷含量。

1.2.6 不同離子對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，分別加入KCl、FeCl3、CuCl2、FeCl2、SnCl2溶液，室溫下放置1 h 測(cè)定其吸光度，計(jì)算越橘花色苷含量。

1.2.7 不同氧化劑對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，分別加入H2O2、FeCl3、CuCl2溶液，室溫放置2.0 h，每隔0.5 h 取樣測(cè)定其吸光度，計(jì)算越橘花色苷含量。

1.2.8 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取pH、溫度、時(shí)間3個(gè)對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性影響較大的因素，以花色苷的含量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，考察越橘花色苷的穩(wěn)定性，正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9（33）Table1 Factors and levels in the orthogonal array experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘花色苷檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

由圖1 可知越橘花色苷在波長(zhǎng)為440 nm～680 nm之間有一最大吸收峰（圖上的1 所標(biāo)注位置）值為520 nm。因此選取λ=520 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 越橘花色苷的全波長(zhǎng)吸收?qǐng)D譜Fig.1 The absorb curve of the anthocyanin of lingonberry at a whole wavelength

2.1.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇3 個(gè)不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，得最終的回收率分別為96.0 %，98.1 %和101.3 %，說(shuō)明在pH=1.0，λ=520 nm 波長(zhǎng)條件下0.295～0.870 7 吸光度值在范圍內(nèi)，對(duì)越橘花色苷含量測(cè)定準(zhǔn)確有效。

2.2 越橘花色苷穩(wěn)定性的研究

2.2.1 pH 對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

pH 對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH 對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of the different pH conditions on the stability of lingonberry anthocyanins

由圖2 可知，在pH1.0～pH3.0 之間時(shí)，越橘花色苷的含量相對(duì)穩(wěn)定，且在pH=3.0 時(shí)含量最高，達(dá)0.257 mg。隨著pH 的逐漸加大，越橘花色苷含量逐漸降低，說(shuō)明越橘花色苷在pH=3.0 時(shí)穩(wěn)定性較高。

2.2.2 溫度對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of different temperatures on the stability of lingonberry anthocyanins

由圖3 可知，越橘花色苷的含量隨溫度的增加呈明顯的下降趨勢(shì)，說(shuō)明溫度越低越橘花色苷穩(wěn)定性越好。

2.2.3 時(shí)間對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

時(shí)間對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different storing time on the stability of lingonberry anthocyanins

由圖4 可知，隨著放置時(shí)間的增加，越橘花色苷的含量總體呈下降趨勢(shì)，放置時(shí)間越長(zhǎng)其穩(wěn)定性就越差；可能是由于其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的緣故，也可能是在放置過(guò)程中受到光照等其他因素的影響而使含量發(fā)生變化。

2.2.4 不同離子對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

不同離子對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同離子對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of different ions on the stability of lingonberry anthocyanins

從圖5 可以看出，不同金屬離子對(duì)越橘花色苷的穩(wěn)定性均有不同程度的影響。其中K+、Fe2+、Sn2+對(duì)越橘花色苷有一定的保護(hù)作用，而Fe3+、Cu2+對(duì)花色苷的穩(wěn)定性影響較大，花色苷損失較多，可能是越橘花色苷中的酚羥基結(jié)構(gòu)與Fe3+、Cu2+發(fā)生反應(yīng)生成沉淀，使其穩(wěn)定性降低。

2.2.5 不同氧化劑對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

不同氧化劑對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表2。

表2 不同氧化劑對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of the different oxidants on the stability of lingonberry anthocyanins

從表2 可知，不同氧化劑對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性都有不同程度的影響，而H2O2和FeCl3在同一濃度下比CuCl2對(duì)越橘花色苷的影響要明顯，而且各種氧化劑對(duì)越橘花色苷的破壞程度與濃度存在一定的關(guān)系，濃度越高，花色苷受破壞的程度越大，其的穩(wěn)定性就越低；在不同的時(shí)間段內(nèi)，氧化劑對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響也不同，前期H2O2作用更為明顯，后期FeCl3、CuCl2較為明顯。氧化劑H2O2前期對(duì)花色苷的穩(wěn)定性影響更為明顯，可能是由于過(guò)氧化氫容易分解，隨著時(shí)間延長(zhǎng)其分解程度加大，氧化性降低的緣故。

2.2.6 正交試驗(yàn)

L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the optimizing examination

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of the analysis of variance

從表3 可看出，在pH1.0～pH3.0 的范圍內(nèi)，溫度、pH、時(shí)間三因素對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響大小依次為：溫度＞pH＞時(shí)間。由表4 可知，在處理3 中越橘花色苷降解量最大，即在pH=1.0 溫度40 ℃時(shí)間5 h 條件下花色苷穩(wěn)定性最低；處理7 中花色苷的降解量最少，即當(dāng)溫度4 ℃、pH=3.0、時(shí)間5 h 時(shí)花色苷穩(wěn)定性最強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)越橘花色苷的穩(wěn)定性的影響因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同的試驗(yàn)條件處理對(duì)花色苷的穩(wěn)定性影響程度不同，在溫度4 ℃、pH=3.0、時(shí)間5 h 時(shí)花色苷穩(wěn)定性最好，這可能是花色苷貯藏的最佳條件。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究并未涉及糖苷酶，多酚氧化酶等酶類(lèi)以及輔色劑、糖及降解產(chǎn)物等對(duì)越橘花色苷穩(wěn)定性的影響。隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，通過(guò)化學(xué)修飾等技術(shù)手段改變?cè)介倩ㄉ盏慕Y(jié)構(gòu)或通過(guò)生物工程技術(shù)方法生產(chǎn)高穩(wěn)定性的細(xì)胞等方法來(lái)提高越橘花色苷的穩(wěn)定性可能是未來(lái)發(fā)展的一個(gè)方向。

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