張麗花

江蘇省張家港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 張家港 215600

一種幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)和保存方法介紹

張麗花

江蘇省張家港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 張家港 215600

目的：介紹一種幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）臨床菌株的分離培養(yǎng)和保存方法。方法：采用心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基，同時(shí)以微需氧盒和微需氧袋對(duì)50份臨床標(biāo)本培養(yǎng)HP，并以心腦浸液液體培養(yǎng)基保存菌株。結(jié)果：微需氧盒中共檢出23份HP陽(yáng)性，而微需氧袋中只檢出3份HP陽(yáng)性。心腦浸液液體培養(yǎng)基保存菌株復(fù)蘇成功率為95.6%。結(jié)論：心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基微需氧盒法可以成功分離培養(yǎng)HP，心腦浸液液體培養(yǎng)基保存菌株復(fù)蘇成功率高。

幽門螺桿菌；分離培養(yǎng)；菌種保存

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）是一種螺旋狀、革蘭染色陰性、微需氧的細(xì)菌，由Warren和Marshall于1983年成功從胃黏膜組織中分離［1］。現(xiàn)已證實(shí)HP與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤以及胃癌密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織／國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（WHO／IARC）將其列為胃癌的I類致癌因子［2－4］。目前有多種方法可用于診斷HP感染，細(xì)菌培養(yǎng)被視為診斷HP感染的金標(biāo)準(zhǔn)［5］，也是HP研究工作的基礎(chǔ)。但由于HP的培養(yǎng)條件要求較高，抵抗力較低，導(dǎo)致許多實(shí)驗(yàn)室不易獲取或保存HP菌種，從而影響研究工作的開展。本文介紹一種簡(jiǎn)便的HP臨床菌株分離培養(yǎng)和保存的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 本院胃炎、消化道潰瘍患者在胃鏡檢查時(shí)取下的胃和十二指腸活組織標(biāo)本50例。病人受檢前2周未服用抗生素、非甾體類抗炎藥、質(zhì)子泵抑制劑、黏膜保護(hù)劑等。

1.1.2 心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基 稱取23.5g心腦浸液瓊脂（OXOID CM0375）在500ml蒸餾水中，煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15分鐘。取出自然冷卻至50℃，加入2ml幽門螺桿菌選擇劑（萬(wàn)古霉素Vancomycin 5mg、頭孢磺啶Cefsulodin 2.5mg、磺胺增效劑Trimethoprim 2.5mg、兩性霉素B Amphotercin B2.5mg，溶于2ml無(wú)菌蒸餾水中），再加入35ml（7%）脫纖維羊血，混勻后澆平板。

1.1.3 心腦浸液液體培養(yǎng)基 稱取0.37g心腦浸液肉湯（OXOID CM0225）于50毫升的小燒杯中，再加入10毫升蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻。把上述溶液轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，連同1ml EP管、甘油一同高壓滅菌。在EP管中加入0.8ml液體培養(yǎng)基、0.05ml胎牛血清、0.15ml甘油，用來(lái)保存HP。

1.1.4 微需氧產(chǎn)氣盒（袋） 法國(guó)生物梅里埃微需氧產(chǎn)氣盒（袋）（GENbox／bag microaer）和微需氧氣體產(chǎn)生囊。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng) 將胃或腸組織塊放入1ml無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖后取各100μl加入二塊相應(yīng)的心腦浸液瓊脂平板中，涂抹均勻；兩塊平板分別放入微需氧盒和微需氧袋（含5%O2、10%CO2、85%N2），快速地將氣體發(fā)生器放入微需氧盒和微需氧袋，再取一塊紗布，用蒸餾水浸濕，避開氣體發(fā)生器，放入微需氧盒和微需氧袋中，37℃培養(yǎng)3～7天。

1.2.2 菌株鑒定 觀察平板，挑取可疑菌落，革蘭氏染色，觸酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)，脲酶試驗(yàn)。

1.2.3 菌株保存 挑取少量HP細(xì)菌加入含心腦浸液液體培養(yǎng)基的EP管中，充分混勻，用封口膠封閉、標(biāo)記；放入－70℃速凍冰箱中冷凍保存。

1.2.4 菌株復(fù)蘇 取出菌種，在固體培養(yǎng)基平板中加入1滴菌液，用接種環(huán)涂勻，放入微需氧盒，37℃培養(yǎng)3～5天。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)3～7天培養(yǎng)，產(chǎn)氣盒中共檢出23份HP陽(yáng)性，而產(chǎn)氣袋中只檢出3份HP陽(yáng)性。HP在心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，37℃培養(yǎng)3～5天后才能發(fā)現(xiàn)針尖大小，透明無(wú)色，呈露滴狀，不溶血的菌落。觸酶、氧化酶、脲酶試驗(yàn)陽(yáng)性，革蘭氏染色為陰性的彎曲桿菌，鑒定為HP。

將保存有HP的EP管從中取出，待溶解后接種心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3～5天后，細(xì)菌生長(zhǎng)狀況良好。復(fù)蘇成功率為95.6%。

3 討論

HP是一種生存、生長(zhǎng)條件都非常苛刻的細(xì)菌，對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件要求很高，較一般細(xì)菌難以培養(yǎng)［6－7］。但HP培養(yǎng)還有供純化、保存、分型以及細(xì)菌特性和致病機(jī)制研究等多種科研用途。隨著HP耐藥菌株的日益增加，HP培養(yǎng)還能提供細(xì)菌耐藥性的資料，這對(duì)指導(dǎo)臨床用藥極為重要［8－10］。目前，由于各種條件的限制，我國(guó)HP培養(yǎng)主要在大學(xué)附屬醫(yī)院和科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行，這使許多醫(yī)院不能進(jìn)行HP的藥敏測(cè)試，導(dǎo)致臨床上治療HP感染時(shí)，多憑臨床經(jīng)驗(yàn)選擇抗生素，有較大的盲目性。我們運(yùn)用心腦浸液培養(yǎng)基和微需氧產(chǎn)氣盒的方法進(jìn)行HP的培養(yǎng)，方法簡(jiǎn)單，分離效果較好。對(duì)于現(xiàn)有醫(yī)院普通微生物室來(lái)說(shuō)，不需要另外增加儀器設(shè)備，就可以進(jìn)行HP的常規(guī)分離培養(yǎng)。在心腦浸液培養(yǎng)基中加入萬(wàn)古霉素、頭孢磺啶、磺胺增效劑、兩性霉素B后，對(duì)混有其他雜菌的標(biāo)本更能得到滿意的分離培養(yǎng)效果。

我們運(yùn)用了產(chǎn)氣盒和產(chǎn)氣袋二種培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)效果的比較，顯示運(yùn)用產(chǎn)氣盒能得到較好的分離效果，這可能與產(chǎn)氣袋密封性不如產(chǎn)氣盒有關(guān)，很難維持一個(gè)微需氧的環(huán)境有關(guān)。另外，在HP的分離培養(yǎng)中，還應(yīng)注意幾點(diǎn)：①標(biāo)本必須新鮮，運(yùn)送時(shí)間不可超過(guò)3小時(shí)，標(biāo)本必須置入含有2ml以下的無(wú)菌生理鹽水或20%葡萄糖中，并保持溫度在4℃；②將標(biāo)本在無(wú)菌研磨器研磨后接種，比直接涂抹平板更能得到較佳的分離效果；③心腦浸液培養(yǎng)基必須新鮮配制；④培養(yǎng)在37℃的微需氧環(huán)境中要保持非常潮濕的環(huán)境，可以在盒底放紗布并加足量的水分。

［1］Warren JR，Marshall BJ.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis［J］.Lancet，1983，1（8336）：1273－1275.

［2］王仙云，郭愛軍，熊自忠.幽門螺桿菌致胃癌的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15（5）：630－641.

［3］Infection with Helicobacter pylori.IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans Schistosomes，1iver flukes and Helicobacter priori.IARC monographs On the evaluation of carcinogenic risks to humans［M］ VOl61 Lyon：International Agency for Research On Cancer，1994：177－240.

［4］周政，劉有理，王光明，等.幽門螺桿菌感染與胃食管反流的關(guān)系［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（3）：436－437.

［5］張萬(wàn)岱，蕭樹東，胡伏蓮，等.對(duì)幽門螺桿菌若干問(wèn)題共識(shí)意見［J］.世界華人消化雜志，2004，12（10）：2457.

［6］萬(wàn)學(xué)勤，周鵬志，馬峰，等.燭缸法分離培養(yǎng)及冷凍法保存幽門螺桿菌［J］.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，自然科學(xué)版，2011，29（5）：82－85.

［7］劉琳娜，丁士剛，張靜，等.幾種培養(yǎng)幽門螺桿菌方法的比較［J］.胃腸病學(xué)，2012，17（4）：240－241.

［8］呂農(nóng)華，祝蔭.幽門螺桿菌耐藥的現(xiàn)狀與對(duì)策［J］.中華消化雜志，2011，31（1）：66－68.

［9］謝昆華.幽門螺桿菌耐藥現(xiàn)狀及臨床治療對(duì)策［J］.中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué)，2011，4（1）：90－93.

［10］劉苓，胡林，劉婭琳，等.貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的抗生素耐藥現(xiàn)狀［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2012，21（8）：702－705.

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1007－8517（2013）16－0052－02

2013.06.10）

張麗花（1971－），女，本科，副主任技師。研究方向：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)。