李婉兒 浙江老年關(guān)懷醫(yī)院 杭州 310015

陳芝蕓 嚴茂祥 蔡丹莉 姚嘉明 高曉倩 浙江省中醫(yī)院

銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝臟血小板衍生生長因子表達的影響

李婉兒 浙江老年關(guān)懷醫(yī)院 杭州 310015

陳芝蕓 嚴茂祥 蔡丹莉 姚嘉明 高曉倩 浙江省中醫(yī)院

目的：觀察銀杏葉提取物（GbE）對大鼠肝組織PDGF表達的影響。方法：采用CCL4建立大鼠肝纖維化，同時以50、100、200mg/（kg·d）的GbE干預(yù)，以復(fù)方鱉甲軟肝片為對照，連續(xù)6周后取肝組織，采用RT-PCR法檢測肝組織PDGFmRNA表達，免疫組化法測定肝組織PDGF蛋白的表達。結(jié)果：模型大鼠肝組織PDGFmRNA和蛋白表達較正常組明顯增高（P＜0.01），GbE和復(fù)方鱉甲軟肝片干預(yù)后大鼠肝組織PDGFmRNA和蛋白表達較模型組顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：GbE可能通過降低肝組織PDGF的表達，抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的進展。

大鼠 肝纖維化 銀杏葉提取物 血小板衍生生長因子

肝纖維化是肝細胞外基質(zhì)產(chǎn)生大于降解的病理過程，肝星狀細胞的激活和轉(zhuǎn)化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)和必要條件。血小板衍生生長因子（plate?let-derived growthfactor，PDGF）是肝星狀細胞最強的有絲分裂原，可使其激活、增殖和分化，在多個環(huán)節(jié)上促進肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GbE）能抑制肝星狀細胞的活化，改善肝組織炎癥活動程度和纖維化程度，有效防治CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維的進展[1-2］。本研究觀察GbE對肝纖維化大鼠肝組織PDGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±10）g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2003-0003。

1.2 主要藥物和試劑 CCL4（批號050615），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；橄欖油（批號20040120），北京京都利德食品有限公司產(chǎn)品（西班牙百葉公司）。GbE（批號050118），西安中鑫生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其中，含黃酮苷和銀杏內(nèi)酯分別為24.03%和6.15%；復(fù)方鱉甲軟肝片，內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司產(chǎn)品（批號20051208）。Trizol，Invitro?gen公司產(chǎn)品（批號1317025）；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV（批號 21542119）、Taq酶（批號130214）、三磷酸脫氧核苷（dNTP，批號230106），Promega公司產(chǎn)品；寡核苷酸（Olig dT），上海博亞公司合成；標準分子量DNA marker DL2000（批號F4801），TaKaRa公司產(chǎn)品。引物由上海鼎安生物科技有限公司合成；PDGF-BB上游引物：5’-CCT GAG GAA CTC TAT GAA ATG C-3’，下游引物：5’ACA TTG CGG TTA TTG CAG C-3’，擴增片段341bp；GAPDH上游引物：5’-GTC GGT GTG AAC GGA TTT-3’，下游引物5’-ACT CCA CGA CAT ACT CAG C-3’，擴增片段247bp。兔抗PDGF-BB多克隆抗體（批號200608），武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二步法免疫組化生物檢測試劑盒PV6002（批號1360）均為北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法 60只大鼠隨機分成正常組、模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、GbE低劑量組、GbE中劑量和GbE高劑量組，每組10只；正常組按3mL/kg皮下注射橄欖油，1周2次，其余各組按3mL/kg皮下注射40%CCL4（以橄欖油配制）1周2次，首次加倍，連續(xù)6周；造模同時復(fù)方鱉甲軟肝片組每天灌服1g/kg的復(fù)方鱉甲軟肝片，GbE低、中、高劑量組每天分別灌服GbE50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg，正常組和模型組灌服等容量蒸餾水，均連續(xù)6周；大鼠以普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。末次給藥當晚大鼠禁食不禁水，次日上午空腹麻醉處死大鼠，取肝組織，取部分肝組織4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋待用；其余肝組織-70℃冰箱中保存。其中GbE中劑量組1只大鼠在灌胃中不慎刺破食管死亡。

1.4 指標檢測 肝組織PDGFmRNA表達采用RT-PCR法：Trizol抽提總RNA，紫外分光光度計測定提純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取cDNA于下列反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)：10×Buffer 4μL、dNTP 10mM/L（0.8μL）、MgCl225mmol/L（4μL）、5U TaqD?NA多聚酶（0.5μL）、模板4μL、上、下游特異引物各1μL，加去離子水至40μL。先在94℃預(yù)變性3min，然后分別按下述條件循環(huán)：①PDGF：變性94×20s，退火68×30s，延伸72×40s，10個循環(huán)，-1℃，再變性94× 20s，退火58×30s，延伸72×40s，30個循環(huán)；②GAP?DH：變性94℃15s、退火57℃30s、延伸72℃C30s，35個循環(huán)；最后均72℃延伸10min，4℃冷卻5min結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠進行電泳2h。采用BioSenSC300凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，計算PDGF與GAPDH的比值。肝組織PDGF蛋白表達采用免疫組織化學(xué)二步法，PDGF陽性細胞為細胞漿呈棕黃色，根據(jù)著色程度及著色細胞陽性范圍進行半定量計分[3］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析、非參數(shù)秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

模型組大鼠肝組織PDGFmRNA和蛋白表達水平均顯著高于正常組（P＜0.01）；GbE中、高劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織PDGFmRNA和蛋白表達水平均不同程度低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），GbE低劑量組PDGFmRNA表達較模型組顯著降低（P＜0.05），蛋白表達則與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1，圖1～2。

表1 各組大鼠肝組織PDGFmRNA和蛋白的表達（）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

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3 討 論

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，目前已經(jīng)證實有多種因素協(xié)同作用參與了HSC的激活、增殖和細胞外基質(zhì)的合成過程。PDGF是HSC強力有絲分裂原，在肝臟主要由庫否細胞產(chǎn)生，以AA、AB、BB三種形式存在，通過自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮作用，促進HSC活化、增殖，并誘導(dǎo)HSC合成TGF等細胞因子，使形成肝纖維化的主要成分細胞外基質(zhì)合成和分泌增多，同時抑制膠原降解，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-6］。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型組大鼠PDGF-BBmRNA及蛋白的表達較正常組明顯增加（P＜0.01），提示纖維化時PDGF的分泌和合成增加。GbE和復(fù)方鱉甲軟肝片干預(yù)后PDGF-BBmRNA和蛋白表達水平較模型組明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)合前期研究GbE和復(fù)方鱉甲軟肝片能抑制肝星狀細胞活化，改善肝組織炎癥活動程度和纖維化程度的結(jié)果［1-2］，提示EbG和復(fù)方鱉甲軟肝片抗大鼠肝纖維化的作用可能與其降低肝組織PDGF表達有關(guān)。

［1］高曉倩，陳芝蕓，張曉蘋，等.銀杏葉提取物抗肝纖維化作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（4）：779-781.

［2］姚嘉明，陳芝蕓，嚴茂祥，等.銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠TGF-β1表達的影響［J］.中國中醫(yī)藥科技，2008，15（3）: 186-188.

［3］徐列明，劉平，呂剛，等.Ⅰ、Ⅳ型膠原及板層素在肝纖維化大鼠肝竇周圍的變化［J］.中華消化雜志，1995，15（3）: 146-148.

［4］Parsons CJ，Takashima M，Rippe RA.Molecularmechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.JGastroenterol Hepatol，2007，22（Suppl1）:S79-84.

［5］Liu Y，Wen XM，Lui EL，etal.Therapeutic targeting of the PDGF and TGF-beta-signaling pathways in hepatic stellate cells byPTK787/ZK22258［J］.Lab Invest，2009，89（10）: 1152-1160.

［6］SiHF，LV X，Guo A，etal.Suppressive effectof leflunomide on rat hepatic stellate cell proliferation involves on PDGFBB-elicited activation of three mitogen-activated protein kinases［J］.Cytokine，2008，42（1）:24-31.

Effects of Ginkgo Biloba Extract on the Expression of Platelet-derived Grow th Factor in Rat Liver Tis?sues w ith Hepatic Fibrosis

LI wan’er，CHEN Zhiyun，YAN Maoxiang，et al.Zhejiang Aged Care Hospital,Hang?zhou(310015),China

Objective:To investigate the effects of ginkbo biloba extract(GbE)on the expression of platelet-de?rived growth factor(PDGF)in rat liver tissues with hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCL4). M ethods:Rat models of hepatic fibrosis were induced by CCL4and were treated with GbE of 50,100,and 200 mg/kg·d,respectively,for 6 weeks.Biejia Ruangan tablets served as control treatment.At the end of the 6th week,all the rats were painless killed.The transcription of PDGF mRNA in the livers of these rats was ana?lyzed by RT-PCR and the expression of PDGF protein was detected by immunohistochemistry.Results:The ex?pressions of PDGF mRNA and protein were remarkably higher in rat livers with hepatic fibrosis than those in normal ones(P＜0.01),while both GbE and Biejia Ruangan tablets significantly reduced the expressions of PDGF at both levels when compared with the model ones(P＜0.05,P＜0.01).Conclusions:CCL4-induced hepatic fibro?sis may be inhibited by GbE through reducing the expression of PDGF in rat livers.

rats liver fibrosis Ginkgo biloba extract platelet-derived growth factor

2013-01-09

浙江省中醫(yī)藥重點研究項目目計劃（No.2006Z0060）、浙江省中醫(yī)藥青年課題研究計劃（No.2009YA006）

陳芝蕓，Tel：13395812025； E-Mail：zhiyuan_chen63@yahoo.com.cn