汪強武 王啟之＊ 于東紅 燕善軍 周 蕾 吳 炎 田 怡 承澤農(nóng)

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，安徽233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽233003；3廣東省深圳市南山區(qū)中心醫(yī)院消化科，深圳518052；4上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院消化科，上海201100）

胃癌是最常見的惡性腫瘤，探討胃癌的病因?qū)W和發(fā)病機制一直是科研工作者研究熱點。幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，Hp可通過誘發(fā)炎癥、調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達、誘導(dǎo)胃粘膜上皮增殖和凋亡異常及其代謝產(chǎn)物包括一些酶類、毒素和蛋白直接損害胃粘膜等形式引起胃癌發(fā)生。本文旨在檢測胃癌、慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生胃粘膜Hp及其CagA基因、P53、iNOS，探討其與胃癌的相關(guān)性。

材料和方法

1．材料

標(biāo)本：胃癌、慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生組織取自我院2002年3月至2003年9月、2010年9月至2012年3月胃鏡活檢標(biāo)本，胃癌377例，其中男262例，女115例；慢性淺表性胃炎306例，其中男232例，女74例；慢性萎縮性胃炎58例，其中男36例，女22例；腸上皮化生50例，其中男32例，女18例；不典型增生73例，其中男51例，女22例。所選病例胃鏡下活檢通過病理檢查進一步證實。每例患者從病變處取六塊活檢標(biāo)本，其中四塊送病理檢查，一塊作尿素酶試驗，一塊裝于無菌進口凍存管，冷凍于－80℃保存。快速尿素酶試驗試劑盒：三明三強公司；幽門螺桿菌免疫印跡試劑盒：深圳伯勞特生物制品有限公司；P53、iNOS免疫組化試劑盒：北京中山實業(yè)有限公司；UNIQ柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒：上海生工；CagA 基因引物1序列：5′－GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAGG－3，引 物 2 序 列：5′－CTG CAA AAG ATT GTT TGC GAGA－3，由上海生工合成。

2．方法

2．1快速尿素酶試驗

將鉗取后的活檢組織塊迅速放入快速尿素酶試劑盒中，在30℃左右條件下觀察試劑的顏色變化，如試紙由淡黃色變?yōu)榧t色，則為陽性；試紙不變色（仍為淡黃色）為陰性。胃粘膜組織Hp感染的輕、中、重度分別以＋、＋＋、＋＋＋表示。

2．2血清HpCagA抗體檢測

每位患者于胃鏡檢查結(jié)束后抽取靜脈血2ml，常溫下分離血清，抗體檢測按試劑盒中所述步驟進行，待陽性帶顯色清楚，干燥后對比標(biāo)準(zhǔn)帶判斷結(jié)果。

2．3病理切片染色找Hp

根據(jù)活檢標(biāo)本的病理號（見病歷或活檢標(biāo)本病理報告出來后取胃鏡報告單所登記）找到病理教研室的存檔蠟塊，并切病理薄片，行革蘭氏染色，油鏡下（×100）觀察并計數(shù)，每例隨機觀察10－15個視野，分別取Hp平均數(shù)，Hp均數(shù)≥20個定為陽性，＜20個或未查見Hp則為陰性，以排除因染色原因而造成的假陽性。Hp呈螺旋形，“S”形或海鷗形。

2．4HpCagA基因檢測

取活檢胃粘膜組織塊（－80℃保存），未等解凍，用研缽研碎收集到1．5ml無菌離心管中，用200μlTE懸浮，用柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒（操作步驟詳見說明書）提取出DNA樣品－4℃或－20℃保存。反應(yīng)體系如下：10×PCR 緩沖液5μl，10μmol／L dNTP 1μl，引物1、2各取1．5μl，25mmol／L Mgcl2 3μl，TaqDNA酶1μl，Hp DNA提取液5μl，water（無核酸酶）32μl，石蠟油20μl覆蓋。于94℃預(yù)變性5min后，94℃1min（變性）55℃1min（退火）72℃1．5 min（延長）35個循環(huán)后，72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物6μl于瓊脂糖凝膠電泳。電泳條件87．5mv，30min于紫外線透射儀上觀察，于349bp處出現(xiàn)橙黃色條帶為CagA基因陽性（如圖1所示）。

2．5免疫組織化學(xué)檢查

采用SP法染色程序按SP法操作常規(guī)進行。對P53、iNOS抗原進行微波修復(fù)，同時在同一條件下以PBS代替一抗為陰性對照，以已知P53和iNOS蛋白陽性的胃癌為陽性對照。

3．統(tǒng)計學(xué)方法

采用χ2檢驗和四格表確切概率法，P＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．Hp和CagA基因的檢測

革蘭氏染色找Hp，結(jié)合快速尿素酶試驗及免疫印跡試驗檢測血清HpCagA抗體三者有兩項或以上陽性診斷為Hp感染。胃癌、慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生標(biāo)本中CagA基因PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖1。

2．免疫組化SP法檢測突變P53、iNOS結(jié)果判定

突變P53陽性為細(xì)胞核著棕黃色細(xì)顆粒（圖2），iNOS陽性為細(xì)胞質(zhì)著棕黃色細(xì)顆粒（圖3），＞10%的病變細(xì)胞為陽性時才判定為陽性。

3．不同胃疾病中Hp和CagA感染率比較

各種組織中Hp和CagA＋株感染率的結(jié)果顯示，胃癌組Hp感染率與淺表性胃炎、萎縮性胃炎和腸上皮化生組差異均無顯著性（P＞0．05），胃癌組Hp感染率與不典型增生組相比差異顯著（P＜0．05），而萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生組與淺表性胃炎組Hp感染率相比差異顯著（P＜0．05）。而不典型增生、胃癌組CagA＋株感染率則高于淺表性胃炎組（P＜0．01），腸上皮化生組CagA＋株感染率則高于淺表性性胃炎組（P＜0．05），胃癌組CagA＋株感染率則高于萎縮性胃炎組（P＜0．05），萎縮性胃炎組CagA＋株感染率高于淺表性胃炎組，但統(tǒng)計學(xué)無差異（P＞0．05）（表1）。

圖1 胃癌、慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生組織CagA基因PCR擴增產(chǎn)物。圖2 胃癌細(xì)胞P53表達陽性（細(xì)胞核呈棕黃色細(xì)顆粒狀）SP法×400圖3 胃癌細(xì)胞iNOS表達陽性（細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒狀）SP法×400Fig．1The PCR amplification products of CagA gene in different stomach diseases．M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為慢性淺表性胃炎組織CagA基因陽性帶；2、5為CagA基因陰性；3為慢性萎縮性胃炎組織CagA基因陽性帶；4為腸上皮化生組織CagA基因陽性帶；6為不典型增生組織CagA基因陽性帶；7為胃癌組織CagA基因陽性帶Fig．2The expression of p53in carcinoma cell of stomach by immunohistochemically staining（SP method×400）Fig．3The expression of iNOS in carcinoma cell of stomach by immunohistochemically staining（SP method ×400）

表1 不同胃疾病中Hp和CagA感染率比較Table 1 Comparisons of HP and CagA infection rates in different stomach diseases

4．不同胃疾病中CagA感染與突變P53、iNOS的表達關(guān)系

從慢性淺表性胃炎到胃癌演變過程中，CagA基因陽性組中的突變P53表達逐漸升高（34．3%－76．8%），CagA基因陽性組中的iNOS表達逐漸升高（75．5%－93．6%）；除慢性淺表性胃炎外，慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌組CagA基因陽性組突變P53表達明顯高于CagA基因陰性組突變P53表達（P＜0．005－P＜0．05）；慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌組CagA基因陽性組iNOS表達均高于CagA基因陰性組iNOS表達（P＜0．005－P＜0．05）（表2）。

表2 不同胃疾病中CagA感染與突變P53、iNOS的表達關(guān)系Table 2 The relationship among CagA infection and expression of P53、iNOS in different stomach diseases

討 論

幽門螺桿菌是一種螺旋狀微需氧細(xì)菌，是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，并且Hp感染與胃腺癌、胃粘膜相關(guān)性淋巴組織惡性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1］。

1990年，Cover等發(fā)現(xiàn)Hp培養(yǎng)液中存在相對分子量為12800的蛋白質(zhì)，它雖不直接表達毒素活性，但與毒素活性表達密切相關(guān)，稱為細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白，即CagA。目前對Hp、CagA基因與胃十二指腸疾病的關(guān)系報道眾說紛紜。

本研究發(fā)現(xiàn)淺表性胃炎Hp感染率46．7%，慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生組織中Hp感染率逐漸升高。萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生是正常胃粘膜或淺表性胃炎向胃癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵病理形式，在它們的組織中檢測到較高的Hp感染率，從而證明Hp與胃癌前病變及胃癌形成可能存在一定關(guān)系。但胃癌Hp感染率53．8%，與淺表性胃炎組Hp感染率相比無顯著差異（P＞0．05）；可能是胃組織發(fā)生癌變后，胃內(nèi)環(huán)境已不適合Hp的生存，致Hp死亡或遷移。

本研究還發(fā)現(xiàn)慢性淺表性胃炎CagA基因表達率為34．3%，從慢性萎縮性胃炎至胃癌CagA基因表達率逐漸升高。雖CagA本身無細(xì)胞毒活性，但與VacA的轉(zhuǎn)錄、折疊、運轉(zhuǎn)功能等有關(guān)，CagA編碼的細(xì)胞毒素蛋白可致宿主出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［2］。長期CagA＋基因株感染使胃粘膜氧自由基、超氧化物生成增加，表面上皮細(xì)胞變性壞死、修復(fù)與增生、進而使腺體發(fā)生分化障礙與萎縮，形成腸上皮化生和不典型增生，最后可能形成胃癌［3］。CagA基因在胃癌前病變及胃癌高表達，機制可能為CagA＋基因株產(chǎn)生多種毒素可導(dǎo)致胃粘膜細(xì)胞抑癌基因表達減弱和癌基因過度表達，導(dǎo)致基因突變而發(fā)生胃癌；國外學(xué)者Yamaoka等［4］進一步研究發(fā)現(xiàn)CagA基因3’端的超過3個的重復(fù)區(qū)域能加重組織損害使Hp更易在酸性環(huán)境下生存，與腸化生、萎縮及腫瘤有關(guān)。Williams等［5］報道CagA陽性Hp可能致胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌組織病理和染色體異常，通過 ROS （reactive oxygen species）介導(dǎo)腫瘤發(fā)生。各種胃疾病組織中CagA感染率逐漸升高，也說明了CagA基因參與各種胃癌前病變發(fā)生直至最后形成胃癌。

正常野生型p53基因的蛋白產(chǎn)物不穩(wěn)定，半衰期僅20分鐘，不能用免疫組化方法可以檢測到。而突變型p53蛋白半衰期明顯延長，用免疫組化方法能夠檢測到的p53蛋白均為突變型［6］。

關(guān)于Hp感染與P53突變報道不一［7］。Lima－VP等［8］研究發(fā)現(xiàn)胃癌形成機制有賴于Hp相關(guān)的凋亡參與和EB病毒參與的C－myc和Bax低表達，而P53突變只是胃癌形成中的一個獨立事件。還有學(xué)者認(rèn)為僅CagA陽性Hp感染在胃癌患者P53突變中起重要作用［9］。本研究結(jié)果表明突變P53表達在腸上皮化生和不典型增生組明顯高于慢性淺表性胃炎，說明P53基因突變已經(jīng)介入這種胃粘膜病變的形成，Hp陽性組和Hp陰性組相比，突變P53表達無顯著差異，說明在胃粘膜病變的形成早期，P53基因突變可能與Hp感染無確定關(guān)系。本研究還顯示突變P53在胃癌表達明顯高于慢性淺表性胃炎，且胃癌CagA基因陽性中突變P53表達率高，說明CagA基因誘導(dǎo)P53基因突變并最終可能形成胃癌。Hp的CagA蛋白可通過影響胃粘膜細(xì)胞的增生和凋亡，增加DNA損傷的可能性，DNA的損傷又可引起突變P53的高表達，引起細(xì)胞增生和凋亡的失衡，進而形成胃癌［10］。

在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌患者中，CagA基因陽性組較CagA基因陰性組的突變P53檢出率高，CagA＋株可能導(dǎo)致P53基因突變，細(xì)胞凋亡抑制，使慢性炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞增生無法控制，CagA＋株感染與P53突變有非常顯著的相關(guān)性，表明Hp的毒力越強，P53基因越易突變，胃癌發(fā)生率就越高［11］。新近 Kim N［12］運用多變量分析研究發(fā)現(xiàn)萎縮性胃炎的危險因素主要是Hp、年齡大于60歲、CagA基因和VacA基因感染及P53，也支持我們的觀點。因此CagA基因在胃癌發(fā)生的起始階段可能起了“啟動子”作用，Hp誘導(dǎo)P53突變參與胃癌形成屬于較晚期事件，且Hp致P53突變與CagA相關(guān)。

研究亦顯示，在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌組CagA基因陽性組iNOS檢出率明顯高于CagA基因陰性組iNOS檢出率。

iNOS為一種誘生型酶，在大多數(shù)組織中不表達，但在一些炎性細(xì)胞因子、生長因子、內(nèi)毒素作用下，呈高表達并發(fā)揮病理作用［13］。Hp感染可上調(diào)iNOS的表達，iNOS的表達與胃粘膜的炎癥程度密切相關(guān)。Cho SO等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在胃上皮細(xì)胞中，通過Ras介導(dǎo)，經(jīng)AP－1活化，Hp可誘導(dǎo)COX－2和iNOS的表達，致使胃粘膜內(nèi)NO含量增多。

Kaise等［15］發(fā)現(xiàn)，Hp感染在iNOS啟動子長鏈CCTTT基因攜帶者中導(dǎo)致iNOS mRNA的高表達，故長鏈CCTTT基因攜帶者發(fā)生胃癌的危險性高。有學(xué)者認(rèn)為萎縮性胃炎的腺體的消失是由于NO介導(dǎo)細(xì)胞凋亡所致，但損傷的細(xì)胞如逃避了凋亡機制，則可能發(fā)生癌變。

研究進一步表明，各種胃粘膜病變因CagA基因陽性引起iNOS升高，產(chǎn)生大量NO，NO參與胃癌的形成。NO可引起IL－8的產(chǎn)生；NO可直接損傷DNA；NO轉(zhuǎn)化成硝酸鹽和亞硝胺，對胃癌形成有一定作用；NO可通過VEGF促腫瘤血管形成，參與腫瘤的侵襲、生長、轉(zhuǎn)移［16］。

HpCagA＋株感染導(dǎo)致萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃癌的過程中，首先激活了胃上皮細(xì)胞炎癥細(xì)胞，產(chǎn)生大量活性氧、COX－2、iNOS、IL－6、IL－8等，這些炎癥介質(zhì)活化NF－KB；HpCagA的過度表達，增強胃粘膜細(xì)胞中iNOS和VEGF的表達，促進胃粘膜細(xì)胞癌基因c－erbB－2和ras的 活 化［17］；HpCagA 的 表 達，致iNOS高表達，演變?yōu)槟c化，最終形成腸型胃癌［18］。

趙亞剛等［19］研究發(fā)現(xiàn)，iNOS也可通過硝酸鹽類、炎癥介質(zhì)、p53癌基因參與胃癌形成，增強胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移力。

Perfetto B研究發(fā)現(xiàn)Th1類細(xì)胞因子如IFN－r表達iNOS基因，在P53、bax基因參與下，致Hp感染引起胃粘膜損害，同時避免宿主的防御反應(yīng)［20］。Hp感染特別是CagA陽性患者胃粘膜iNOS增多和氧自由基釋放，進而引起DNA損傷和P53基因突變。隨著P53突變基因表達量的積累及其它致癌因素的共同作用，細(xì)胞便無限生長。進一步揭示了P53基因突變在胃癌形成中屬晚期事件，當(dāng)然亦不能忽視CagA基因、iNOS和氧自由基等因素在胃癌形成中作用。

胃癌的形成機制非常復(fù)雜，決不可能由一種因素引起或一個基因控制。Hp可能通過多種毒力因素及未發(fā)現(xiàn)的其它基因的綜合作用促進突變P53過度表達致癌［21］。另一方面，Hp感染致胃癌在某些情況下缺乏生物學(xué)依據(jù)，且一部分胃癌組織CagA基因不表達，甚至Hp檢測也為陰性，說明癌變機制有CagA基因外的其他機制參與，如P53、iNOS等基因。

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