王 蒴 方 瑾

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，醫(yī)學細胞生物學教育部重點實驗室，衛(wèi)生部細胞生物學重點實驗室，沈陽110001）

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。早診斷、早治療是提高大腸癌治愈率的關鍵。通過從分子水平對腫瘤相關標志物的高靈敏度檢測，有助于腫瘤的診斷、治療及預后判斷［1－2］。LEA（large external antigen，LEA）是在大腸癌細胞表面表達的一種腫瘤相關抗原。相關研究表明，LEA的表達具有一定的組織特異性，即在正常組織、非大腸癌及低分化大腸癌組織中，幾乎不表達或表達率很低，在中高分化大腸癌組織中高度表達，對其檢測有助于實現(xiàn)大腸癌的早期診斷［3］。ND－1是利用雜交瘤技術制備的抗LEA的單克隆抗體，研究顯示，該抗體可與表達有LEA的大腸癌細胞特異性結合［4］，有可能發(fā)展為有效的分子探針，實現(xiàn)大腸癌的特異性成像和檢測。

量子點（Quantum dots，QDs）是一種新型的熒光染料，一般是由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素組成的納米級半導體顆粒。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，量子點具有的特點是激發(fā)光譜寬且連續(xù)，發(fā)射光譜窄且對稱；熒光強度高，是普通熒光染料的10－20倍，檢測的靈敏度高；抗光漂白能力強，適合長時、動態(tài)的生命過程的研究；利用發(fā)射波長位于紅外區(qū)的量子點可以實現(xiàn)在活體動物體內深層組織的成像研究［5－8］。

研究采用共價偶聯(lián)方式制備ND－1與量子點QD605的熒光探針，并通過條件優(yōu)化獲得最佳的偶聯(lián)效率，采用該探針成功實現(xiàn)對大腸癌細胞的靶向識別和特異性成像。

材料和方法

1．材料

人大腸癌細胞系CCL187、人宮頸癌細胞系He－La、雜交瘤細胞株IC2為本室保存。BALB／c小鼠購于中國醫(yī)科大學實驗動物部。量子點（QD605）購于武漢珈源量子點技術公司。1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1－Ethyl－3－（3－dimethyllaminopropyl）－carbodiie－h(huán)ydrochlide，EDC）、N－羥 基 硫 代琥珀 酰 亞 胺 （N－Hydroxysulfosuccinimide sodium salt，NHS）、DAPI、降植烷購于 Sigma－Aldrich公司。

2．方法

2．1單克隆抗體ND－1的制備、純化及鑒定

取6－8周齡純系雌性BALB／c小鼠，腹腔內注射降植烷0．5ml／只進行體內免疫抑制反應，7日后等量注射第二次。一周后，腹腔注射對數(shù)生長期的雜交瘤細胞IC2，細胞密度為1－2×106／ml，注射劑量為0．5ml／只，10－20日后陸續(xù)抽取腹水。收集的腹水經(jīng)離心、透析后，HiTrap protein G柱親和層析純化，SDS－PAGE電泳測定抗體純度，Bradford法測定抗體濃度，并將抗體濃度調整至1mg／ml，4℃保存、備用。以純化后ND－1為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG為二抗孵育人大腸癌細胞CCL187，熒光顯微鏡下檢測單克隆抗體ND－1的免疫活性。

2．2量子點熒光探針ND－1－QD605的制備及條件優(yōu)化

取一定量的 QD605，分別加入0．1mol／L EDC和0．01mol／L NHS，搖動反應15min，超濾后即為量子點活化液。取100μl量子點活化液，分別加入不同量ND－1，搖動反應90min后，10000rpm離心2min，上清液即為偶聯(lián)產(chǎn)物ND－1－QD605。本研究分別在量子點：抗體蛋白摩爾比為1∶20，1∶40，1∶80條件下進行偶聯(lián)，反應產(chǎn)物經(jīng)0．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過電泳條帶分析，確定偶聯(lián)的最佳條件。

2．3ND－1－QD605熒光特性檢測

2．3．1ND－1－QD605激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

分別取400μl ND－1－QD605溶液和游離量子點QD605，利用熒光分光光度計掃描各自的激發(fā)光譜，掃描范圍200nm－800nm；再以掃描得到的最大激發(fā)波長為激發(fā)光，掃描偶聯(lián)產(chǎn)物與游離量子點發(fā)射光譜，掃描范圍400nm－800nm。

2．3．2ND－1－QD605抗光漂白能力檢測

取400μl ND－1－QD605溶液置于熒光分光光度計樣品室內，用488nm的激發(fā)光持續(xù)照射1h，實時測定其熒光強度，得到時間―熒光強度曲線，通過分析熒光強度的變化，考察ND－1－QD605的抗光漂白能力。

2．4ND－1－QD605對靶細胞 CCL187的特異性免疫熒光成像

取蓋片培養(yǎng)的人大腸癌CCL187細胞，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS漂洗3次；滴加 ND－1－QD605，37℃濕盒孵育1h，PBS漂洗3次；DAPI避光染色5min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光信號。以PBS和游離量子點QD605替代ND－1－QD605孵育CCL187細胞為空白對照組，用ND－1－Q D605孵育LEA陰性表達的人宮頸癌HeLa細胞為陰性對照組。

結 果

1．單克隆抗體ND－1的制備、純化及檢測

純化后的單克隆抗體ND－1經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測，在55kD及25kD附近呈現(xiàn)清晰的兩條帶（圖1），與IgG抗體的重鏈和輕鏈的理論分子量一致，經(jīng)凝膠成像掃描顯示，抗體純度達到95%。免疫熒光檢測結果顯示（圖2），ND－1能夠與表達有LEA的CCL187細胞特異性結合，細胞表面呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。

2．ND－1－QD605制備及電泳檢測

以不同摩爾比的游離量子點QD605和ND－1抗體混合制備ND－1－QD605。瓊脂糖電泳結果如圖3所示，二者比例為1：20時，電泳圖中可見ND－1－QD605和游離量子點QD605兩條帶，提示反應體系中量子點過量；隨著抗體蛋白比例的增加，QD605條帶消失，同時ND－1－QD605條帶遷移速率減慢，可能的原因是伴隨抗體比例的增加，量子點偶聯(lián)的蛋白分子數(shù)量增加，使偶聯(lián)產(chǎn)物分子量增大［9］?？紤]到偶聯(lián)產(chǎn)物分子空間粒徑過大不利于細胞表面抗原的標記，優(yōu)化選取的偶聯(lián)比例為1∶40。

3．ND－1－QD605熒光特性檢測

對ND－1－QD605和游離量子點QD605分別進行光譜掃描，結果如圖4所示，偶聯(lián)后的 ND－1－QD605的熒光激發(fā)光譜的范圍較寬泛，在200nm－600nm范圍內為能量吸收區(qū)域，與QD605相比，激發(fā)波長范圍沒有明顯的改變（圖4A）；發(fā)射光譜檢測顯示偶聯(lián)產(chǎn)物保留了游離量子點在605nm處的特征發(fā)射峰，峰型對稱（圖4B）；同時，在被檢測的量子點濃度相同的條件下，偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強度明顯高于游離量子點。

將ND－1－QD605溶液置于熒光分光光度計樣品室內，用488nm激發(fā)光持續(xù)照射樣品溶液進行抗光漂白實驗，結果如圖5所示，在持續(xù)激發(fā)照射1h內，ND－1－QD605溶液的熒光信號強度未發(fā)生明顯改變。

4．ND－1－QD605對靶細胞CCL187的特異性免疫熒光成像

以ND－1－QD605孵育表達有LEA的CCL187細胞，DAPI對核復染，熒光顯微鏡下觀察可見，CCL187細胞表面呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，核復染顯示紅色熒光信號定位于細胞膜上（圖6A、6B、6C）。在以PBS和游離量子點QD605代替ND－1－QD605的空白對照組，未見量子點熒光顯像（圖6D、6E、6F）；以 ND－1－QD605孵育LEA表達陰性的 HeLa細胞，也未見特異性成像（圖6G、6H、6I）。

圖6 ND－1－QD605標記CCL187細胞和 HeLa細胞的熒光圖像（×100）A：ND－1－QD605標記CCL187細胞；B：DAPI染色示CCL187細胞核；C：A和B的合并圖像；D：PBS和游離量子點QD605標記CCL187細胞；E：DAPI染色示CCL187細胞核；F：D和E的合并圖像；G：ND－1－QD605標記HeLa細胞；H：DAPI染色示Hela細胞核；I：G和H的合并圖像Fig．6Fluorescence images of CCL187cells and HeLa cells labeled with ND－1－QD605（×100）A：CCL187cells labeled by ND－1－QD605；B：CCL187cell nuclei stained with DAPI；C：Overlap images in A and B；D：CCL187cells labeled by PBS and free QD605；E：CCL187cell nuclei stained with DAPI；F：Overlap images in D and E；G：He－La cells labeled by ND－1－QD605；H：Hela cell Nuclei stained with DAPI；I：Overlap images in G and H

討 論

研究將抗人大腸癌單克隆抗體ND－1與量子點共價偶聯(lián)，成功制備可以特異性識別大腸癌細胞表面表達的LEA的熒光探針ND－1－QD605，并實現(xiàn)對大腸癌細胞的靶向熒光成像。熒光特性檢測表明，與抗體蛋白共價偶聯(lián)后，該熒光探針仍保留量子點優(yōu)良的熒光特性，即較寬泛的激發(fā)譜線，較窄的發(fā)射譜線，非常強的抗光漂白能力。同時，免疫熒光標記結果顯示，與量子點共價偶聯(lián)后，該抗體蛋白仍具有與細胞表達的抗原的特異結合活性。這些結果表明，將量子點和單克隆抗體ND－1偶聯(lián)后制備的熒光探針，能夠很好地應用于大腸癌細胞特異的免疫熒光成像。

在對ND－1－QD605進行熒光光譜掃描時，我們發(fā)現(xiàn)，與游離量子點相比，偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強度有所增加。量子點能夠產(chǎn)生熒光的原因是當受到激發(fā)光照射時，其表面的電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，同時釋放多余的能量，即產(chǎn)生熒光。在量子點制備過程中，會在量子點表面產(chǎn)生一種結構－－量子阱，它會吸收電子躍遷時產(chǎn)生的能量，降低量子點的熒光效率。當?shù)鞍追肿油ㄟ^共價鍵連接在量子點表面后，可以對其表面結構進行修飾，減少量子阱結構的存在，從而提高量子點的熒光效率［10］。因此，量子點與抗體的偶聯(lián)不僅可以實現(xiàn)量子點的靶向成像功能，還有可能在一定程度上提高基于量子點分析方法的檢測靈敏度。

目前有關量子點免疫探針的制備主要基于兩種策略，（1）非共價偶聯(lián)方式。其中應用最多的是鏈霉親和素－－生物素系統(tǒng)，即將生物素化抗體與鏈霉親和素標記的量子點非共價偶聯(lián)。其特點是操作簡單易行，偶聯(lián)反應的特異性強，偶聯(lián)效率高，產(chǎn)物的穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)高靈敏度檢測。但在活體標記研究中，要先在體外實現(xiàn)生物素化抗體與鏈霉親和素標記分子的非共價連接，然后將偶聯(lián)產(chǎn)物送入體內。通常，一分子鏈霉親和素可以結合四分子的生物素，結果產(chǎn)生分子量很大的偶聯(lián)產(chǎn)物，導致在體內組織間的滲透力較差，直接降低了標記效果［11］。所以，鏈霉親和素－－生物素系統(tǒng)在體內應用尚存在一定的局限性。（2）共價偶聯(lián)方式：即通過共價交聯(lián)反應，使量子點和蛋白質分子間通過酰胺鍵形成復合物。雖然其偶聯(lián)效率稍低于生物素反應系統(tǒng)，但由于抗體與量子點間結合牢固，因而在體內示蹤、動態(tài)監(jiān)測研究中更為有效。本研究為使偶聯(lián)產(chǎn)物具有更為廣泛的應用可能性，采用了EDC和NHS介導的共價偶聯(lián)方式，實現(xiàn)了單克隆抗體ND－1與量子點的有效偶聯(lián)，體外實驗表明偶聯(lián)產(chǎn)物具有特異性靶向結合能力和優(yōu)良的熒光特性。

在共價偶聯(lián)時，我們對量子點和抗體蛋白的摩爾比例進行了優(yōu)化。有研究表明［9］，用量子點進行熒光標記時，量子點與蛋白分子間形成單價結合的偶聯(lián)產(chǎn)物利于成像及信號檢測。但在偶聯(lián)反應中，一個量子點表面可以共價結合多個蛋白分子，其結果是結合在一個量子點上的蛋白分子越多，形成的量子點探針的空間粒徑越大，由于空間位阻的存在，能夠真正結合在抗原或者說細胞表面的探針數(shù)量反而在減少，從量子點熒光信號的角度來看，可以檢測到的熒光信號在下降。因此，調整量子點與蛋白抗體的摩爾比例，實際上是調控一個量子點可以結合的蛋白分子數(shù)量，從而獲得更好的特異性熒光成像?；谶@一考慮，本研究在保證一定抗體－量子點偶聯(lián)率的前提下，選取了抗體比例相對較低的偶聯(lián)條件，獲得了特異性強、靈敏度高的的靶向熒光圖像，這為該量子點探針的實際應用及進一步進行體內靶向成像研究奠定了基礎。

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