宋文慶 武世伍 俞 嵐 周 蕾 承澤農(nóng) 陶儀聲

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽233030）

全球每年新增食管癌病人48萬(wàn)余例，在所有男性惡性腫瘤中占第六位［1］，東亞是食管癌高發(fā)地區(qū)（尤其是中國(guó)、韓國(guó)和日本），其中90%以上的食管癌是鱗狀細(xì)胞癌［2－3］。抑癌基因的缺失可能參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展，而腫瘤誘導(dǎo)的血管生成可能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵襲、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。抑癌基因maspin屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，是通過(guò)消減雜交技術(shù)對(duì)正常乳腺組織與乳腺癌組織比較時(shí)發(fā)現(xiàn)的。近年來(lái)的研究表明，maspin具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的能力，包括血管生成、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)等［4－8］。微血管密度（microvessel density，MVD）是反映腫瘤血管生成情況的一個(gè)很好的指標(biāo)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)100例食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者中 maspin與CD34蛋白的表達(dá)，分析maspin與MVD之間的關(guān)系，并探討它們與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

材料和方法

1．一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2005年1月至2006年6月存檔石蠟包埋ESCC組織標(biāo)本100例（術(shù)前未行放、化療）和正常食管組織30例，所有病例均有完整的臨床病理資料及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2012年4月，隨訪時(shí)間為7－84個(gè)月（中位時(shí)間41．9±28．0）。其中男性77例，女性23例；年齡22－79歲，中位年齡60．7±9．7歲；從腫瘤位置來(lái)看，上段6例，中段73例，下段21例；腫瘤長(zhǎng)徑≥3．0cm有55例，＜3．0cm有45例；根據(jù)腫瘤分化程度，高分化26例，中分化52例，低分化22例；根據(jù)腫瘤浸潤(rùn)深度，黏膜下層13例，肌層41例，外膜33例，穿透外膜13例；按淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移，有轉(zhuǎn)移41例，無(wú)轉(zhuǎn)移59例；根據(jù)AJCC2010版pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，I期10例，II期45例，III期43例，IV期2例。30例正常食管組織作為對(duì)照。

2．試劑

鼠抗人maspin（克隆號(hào)EAW24）和CD34單克?。寺√?hào) QBEnd／101），抗體購(gòu)自 LabVision公司，ElivisonTM plus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

3．免疫組織化學(xué)

將石蠟包埋組織以4μm厚連續(xù)切片，烤干，于二甲苯溶液及梯度濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組織化學(xué)染色操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用已知陽(yáng)性片作對(duì)照，以PBS液代替一抗作空白對(duì)照。然后依次蘇木素淡染細(xì)胞核、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水透明，最后中性樹(shù)膠封片。

4．免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

maspin以細(xì)胞核或漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性；CD34以細(xì)胞漿或膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。MVD通過(guò)CD34陽(yáng)性的小血管來(lái)計(jì)數(shù)，參考修正的Weidner［9］。免疫組織化學(xué)結(jié)果采取二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比并計(jì)分。具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［10］，若積分＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位病理醫(yī)生采用獨(dú)立雙盲法判定。

5．統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。maspin表達(dá)與MVD（因 MVD計(jì)數(shù)的中位值為20．4±8．0，故以MVD＜20為陰性，MVD≥20為陽(yáng)性）陽(yáng)性組與陰性組生存分析用Kaplan－Meier法，組間比較采用log－rank檢驗(yàn)；多因素分析采用Cox回歸多因素模型分析；在ESCC組織中，maspin的表達(dá)以及MVD計(jì)數(shù)與正常食管組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用χ2、Spearman等級(jí)相關(guān)以及t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．maspin在ESCC及對(duì)照組中的表達(dá)

在ESCC組織中maspin主要定位于細(xì)胞核，胞漿中也偶有表達(dá)；在對(duì)照組中，maspin主要表達(dá)于基底細(xì)胞中［11］。maspin在對(duì)照組中均有表達(dá)（30／30），而ESCC中，maspin的陽(yáng)性表達(dá)率為43．0%（43／100），maspin在二組之間的表達(dá)有顯著性差異（P＜0．05，圖1A，1B）。

2．maspin與臨床病理因素的關(guān)系

maspin的表達(dá)與患者性別、腫瘤大小及位置無(wú)相關(guān)性（P＞0．05）。隨著ESCC的分化越差，maspin的表達(dá)率越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；隨著ESCC癌細(xì)胞浸潤(rùn)越來(lái)越深，maspin的表達(dá)率越來(lái)越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；maspin的表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中maspin表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）maspin的陽(yáng)性表達(dá)與生存期長(zhǎng)短有關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，maspin陽(yáng)性表達(dá)組生存期均要長(zhǎng)于其陰性表達(dá)組（圖2A，2B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）；maspin的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，I－II期腫瘤組織中maspin的陽(yáng)性率為65．5%（36／55），III－IV 期腫瘤組織中 maspin的陽(yáng)性率為15．6%（7／45），兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，見(jiàn)表1）。

3．MVD與臨床病理因素的關(guān)系（圖1C，1D）

在maspin陽(yáng)性表達(dá)組，MVD的均值為16．8±6．8），在maspin陰性表達(dá)組，MVD的均值為23．2±7．8，即maspin陽(yáng)性表達(dá)組中的MVD計(jì)數(shù)顯著高于maspin陰性表達(dá)組（表1）。MVD計(jì)數(shù)與腫瘤大小、分化、浸潤(rùn)深度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（P＜0．05，見(jiàn)表1），同時(shí)，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MVD＞22組的病人生存期明顯短于MVD＜22組的病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001），但是在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MVD＞22組的病人生存期與MVD＜22組的病人相比沒(méi)有差異性（P＞0．05）（圖3A，3B）

表1 ESCC中maspin表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)與臨床病理因素的關(guān)系Table 1 Correlation of mircovessel density to maspin expression in Esophageal Cancer

4．預(yù)后及多因素分析

maspin陽(yáng)性表達(dá)組的生存率顯著高于陰性表達(dá)組（P＜0．001，圖4A）；MVD≥22組的生存率顯著低于 MVD＜22組的生存率（P＜0．001，圖4B）。多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、maspin的陽(yáng)性及MVD計(jì)數(shù)均是影響ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0．05，表2）。

表2 100例ESCC患者多因素分析Table 2 Multivariate survival analysis of 100patients with esophageal cancer

討 論

maspin是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，位于染色體18q21．1－q23，編碼一個(gè)42kDa的蛋白，在正常乳腺中可以檢測(cè)到 maspin的表達(dá)［12］。maspin可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移。為了研究maspin在ESCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)maspin蛋白在對(duì)照組食管組織及ESCC中的表達(dá)情況。在對(duì)照組中，maspin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為100%，而在ESCC組中，maspin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為43．0%。從對(duì)照組到ESCC組中，maspin的表達(dá)是降低的。進(jìn)一步研究表明，maspin蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等密切相關(guān)。即maspin的表達(dá)越低，腫瘤的分化越差、浸潤(rùn)越深、臨床分期越高及易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示maspin的表達(dá)降低或缺失可能會(huì)影響ESCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移，可能在食管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起重要的作用，是早期的分子事件［13］。

眾所周知，在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤需要足夠的血供及營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)腫瘤發(fā)展到直徑大于1mm3時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)血管形成以獲取足夠的血供。腫瘤血管形成可以通過(guò)原有血管內(nèi)皮細(xì)胞的芽生，也可以通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞而后形成血管。監(jiān)測(cè)血管生成活性的重要指標(biāo)－MVD，CD34標(biāo)記的MVD能更好的反映腫瘤的血管生成活性［14－15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組中，其MVD計(jì)數(shù)明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組，因此MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；MVD與腫瘤的大小、分化程度、浸潤(rùn)深度及臨床分期等都有關(guān)，而與患者的性別、年齡及腫瘤的位置等無(wú)關(guān)。

本研究表明，在ESCC中，maspin蛋白的表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)具有顯著的負(fù)相關(guān)性。maspin是絲氨酸激酶及MMPs抑制劑，而它們都與腫瘤進(jìn)展有關(guān)；maspin可以通過(guò)減少腫瘤相關(guān)的MVD數(shù)量而抑制腫瘤的生長(zhǎng)［16］。隨著腫瘤的進(jìn)展，maspin基因表達(dá)缺失或降低，喪失了對(duì)MMPs和MVD的抑制作用；且MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而使腫瘤細(xì)胞可以輕易地進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，造成侵襲和轉(zhuǎn)移。

襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成ESCC患者治療失敗的主要原因。本研究多因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、maspin的陽(yáng)性表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0．05）。盡管pTNM分期作為腫瘤的治療標(biāo)準(zhǔn)已為人們所接受，但是尋找一些能對(duì)pTNM分期起到一定補(bǔ)充作用的分子標(biāo)記物并可以反映腫瘤的生物學(xué)行為的分子標(biāo)記物也很重要。

生存分析表明，maspin蛋白表達(dá)陽(yáng)性組的生存率明顯高于其陰性組，而且，無(wú)論淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移，maspin陽(yáng)性表達(dá)組的生存期也都明顯高于陰性表達(dá)組，即maspin陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤患者生存率較高［17］，生存期較長(zhǎng)；MVD≥22組的生存率明顯低于MVD＜22組，MVD計(jì)數(shù)高的腫瘤患者生存率低［14，18］，在沒(méi)有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組中，MVD≥＞22組的病人生存期也明顯短于MVD＜22組的病人，但是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MVD≥22組的病人生存期與MVD＜22組的病人相比沒(méi)有差異性，考慮可能由于樣本量較小，不能完全反映MVD計(jì)數(shù)的高低與病人生存期長(zhǎng)短的關(guān)系，有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，通過(guò)在ESCC組織中檢測(cè)MVD計(jì)數(shù)及maspin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MVD計(jì)數(shù)高以及maspin表達(dá)缺失或降低的ESCC腫瘤細(xì)胞可能更容易侵襲、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。因此，MVD計(jì)數(shù)和maspin可作為評(píng)估ESCC患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)。

圖 版 說(shuō) 明

圖1 maspin在食管鱗狀細(xì)胞癌與正常食管黏膜中的表達(dá)A，B 在對(duì)照組和ESCC中maspin的表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核（A對(duì)照組B食管鱗狀細(xì)胞癌，ElivisionTMplus×400）；C，D MVD與臨床病理因素的關(guān)系（ElivisionTMplus×400）

圖2 A無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中maspin陽(yáng)性組與陰性組ESCC患者生存曲線（log－rank檢驗(yàn)，P＜0．001）；B有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中maspin陽(yáng)性組與陰性組ESCC患者生存曲線（log－rank檢驗(yàn)，P＜0．001）

圖3 A無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MVD≥22組與MVD＜22組的患者生存曲線（log－rank 檢驗(yàn)，P＜0．001）；B有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MVD≥22組與 MVD＜22組的患者生存曲線（log－rank檢驗(yàn)，P＞0．05）

圖4 maspin和MVD陽(yáng)性組與陰性組ESCC患者生存曲線（log－rank檢驗(yàn)），A maspin表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組ESCC患者生存曲線（P＜0．001）；B MVD≥22組與MVD＜22組ESCC患者生存曲線（P＜0．001）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1maspin in normal esophageal tissue and esophageal squamous cell carcinoma A，B：Expression of maspin in cell nucleus（A ．the control group B．esophageal squamous cell carcinoma，ElivisionTMplus ×400）；C，D：MVD relation with clinical pathological factors

Fig．2A：Survival curves of ESCC patients in maspin positive group and negative group without lymph node metastasis group（log－rank test，P＜0．001 ）；B：Survival curves of ESCC patients in maspin positive group and negative group with lymph node metastasis group（log－rank test，P＜0．001）

Fig．3A：Group without lymph node metastasis，MVD≥22 groups and MVD＜22groups of patients survival curves（log－rank test，P＜0．001）；B Group withlymph node metastasis，MVD≥22groups and MVD＜22groups of patients survival curves（log－rank test，P＞0．05）

Fig．4Maspin and MVD positive group and negative group ESCC patients survival curves（log－rank test）A：The expression of Maspin positive group and negative group ESCC patients survival curve（P＜0．001）；B：MVD≥22 group and MVD＜22group ESCC patients survival curve（P＜0．001）

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