郭子葉 蔡春爾，2 李春霞 耿中雷 賈睿，2 何培民，2

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海 201306）

藻膽蛋白（phycobiliproteins，PBP）包括藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）和變?cè)逅{(lán)蛋白（allo-phycocyanin，APC）等，是部分藻類的天然色素，水溶性好，顏色鮮艷，且具熒光特性［1］。70多年來的研究表明，藻膽蛋白用途極為廣泛，可作為天然色素添加于食品、化妝品、保健品、藥品、紡織品、洗滌劑，甚至噴泉中［2，3］，最廣泛的用途是制成熒光標(biāo)記探針［4］，目前主要在Cyanotech Corporation、Martek Bioscience、PROzyme Inc.等大公司出售，價(jià)格高昂［5］。

半個(gè)多世紀(jì)來，人們?cè)囼?yàn)了各種藻膽蛋白制備方法，如Padgett等［6］采用Diethylaminoethyl（DEAE）Cellulose瓊脂糖凝膠層析純化550 gMicrocystis aeruginosa得到33 g純度3.4的PC和2.3 g純度4.0的APC，王廣策等［8］采用疏水層析純化700 gGracilaria verrucosa得到98 mg純度4.4的PE［7］，純化550 gPalmaria palmata得到67 mg純度3.5的PE，Niu等［9］純化15 gPorphyra haitanensis葉狀體得到23 mg純度4.8的PE。此外，還有一些蛋白小量快速制備用于檢測(cè)的簡(jiǎn)單方法［10-12］。藻膽蛋白常規(guī)提純方法的使用效果因原料不同而各有差異［13］，如以中國最主要的栽培藻類之一條斑紫菜為對(duì)象規(guī)模純化藻紅蛋白時(shí)，上述方法似乎不大理想［14］。

藻膽蛋白作為熒光蛋白，摩爾消光系數(shù)表征其吸光能力，熒光量子產(chǎn)率表征其熒光發(fā)射能力，光漂白時(shí)間表征其光耐受能力，這些都是蛋白熒光標(biāo)記和光動(dòng)力學(xué)應(yīng)用中的重要參數(shù)。目前已報(bào)道摩爾消光系數(shù)的藻膽蛋白有壇紫菜藻膽蛋白［15］，多管藻藻紅蛋白，鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白，倒卵圓形隱絲藻藻紅蛋白，集孢藻藻藍(lán)蛋白［16］，已報(bào)道熒光量子產(chǎn)率的有螺旋藻藻膽蛋白［17］，已報(bào)道光漂白效果的有多管藻藻紅蛋白［18］。

目前雖然海洋經(jīng)濟(jì)在中國國民經(jīng)濟(jì)中的地位不斷上升，但海邊的漁民生活卻存在不少問題，魚塘養(yǎng)殖面積逐步減少，水產(chǎn)加工及流通發(fā)展滯后，養(yǎng)殖成本不斷提高，漁業(yè)資源日趨衰竭，傳統(tǒng)捕撈漁民無地可耕，漁民由于年齡、素質(zhì)等原因轉(zhuǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)業(yè)十分困難，使得漁民生活水平難以提高。本試驗(yàn)探索從條斑紫菜中規(guī)模制備高純度藻紅蛋白，旨在今后大規(guī)模制備藻紅蛋白需要大量的紫菜原材料時(shí)，為海邊的紫菜養(yǎng)殖戶開辟新的銷售渠道。而條斑紫菜養(yǎng)殖不但成本低、轉(zhuǎn)型快、操作簡(jiǎn)單，而且生產(chǎn)的藻紅蛋白附加值高，有利于提高農(nóng)民收入。另外，條斑紫菜養(yǎng)殖不僅可為漁民帶來效益，也為海區(qū)環(huán)境治理提供了良方。我們于2002-2004年在中國江蘇呂泗海區(qū)做了養(yǎng)殖條斑紫菜治理海區(qū)富營養(yǎng)化的試驗(yàn)［19］，發(fā)現(xiàn)紫菜養(yǎng)殖可使海水中NH4-N、NO2-N、NO3-N和PO4-P的 含 量 降 低50%-94%、42%-91%、21%-38%和 42%-67%。 在 2003-2004年，300 hm2條斑紫菜養(yǎng)殖海區(qū)年均從海水中去除14 708.5 kg氮元素和2 373.5 kg磷元素，且栽培期間規(guī)?；母蝠B(yǎng)殖未發(fā)生死亡現(xiàn)象。表明條斑紫菜栽培去富營養(yǎng)化作用和生態(tài)修復(fù)功能十分明顯。

本試驗(yàn)以2 kg條斑紫菜為原料，嘗試規(guī)模制備高純度藻紅蛋白的方法，并研究所得蛋白摩爾消光系數(shù)，熒光量子產(chǎn)率及在多種光源下的光漂白時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜葉狀體采自江蘇省呂泗紫菜栽培海區(qū)。藻體用清潔海水洗凈，陰干后密封置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4 L搗碎機(jī)購自美國Warning公司，Supra 22k高速冷凍離心機(jī)購自Hanil Science公司，Ultrospec2000紫外-可見分光光度計(jì)購自Pharmacia Biotech公司，EPS601電泳儀購自Amersham Biosciences公司，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(jì)購自Hitachi公司，伯樂680酶標(biāo)儀購自美國Biorad公司?；瘜W(xué)試劑購自國藥集團(tuán)，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 條斑紫菜搗碎與蛋白釋放 稱取2 kg條斑紫菜，加50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.8，1 mmol/L EDTA）10 L，完全浸沒，4℃存放約36 h。用搗碎機(jī)打碎。搗碎液在4℃下10 000×g離心20 min，取上清。

1.2.2 條斑紫菜藻紅蛋白粗提 上清液在磁力攪拌器攪拌下，加硫酸銨至20%飽和度，靜止8 h，10 000×g離心20 min，取上清液。將上清液續(xù)加硫酸銨至50%終飽和度，靜止8 h，10 000×g離心20 min，取沉淀，沉淀用適量 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液溶解。將兩次鹽析得到的粗提液忽略自身所帶鹽分，加硫酸銨至10%飽和度，靜止8 h，10 000×g離心20 min，取上清液。將上清液續(xù)加硫酸銨至40%終飽和度，靜止8 h，10 000×g離心20 min，取沉淀，沉淀用適量 50 mmol/L緩沖液溶解，此即為藻紅蛋白粗提液，以上步驟均在4℃下操作。

1.2.3 藻紅蛋白層析純化 按Siegelman方法制備HA并預(yù)平衡［20］。藻紅蛋白粗提液用Sephadex G-25柱脫鹽，脫鹽液用羥基磷灰石柱層析，用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）梯度洗脫，洗脫液測(cè)吸光值。將層析所得藻紅蛋白脫鹽后再層析一次。

1.2.4 藻紅蛋白純度鑒定 層析所得藻紅蛋白做光譜和電泳鑒定。藻紅蛋白吸收光譜純度用A565/A280表示［1］。蛋白紫外吸收光譜每隔1 nm掃描一次，掃描波長(zhǎng)范圍250-700 nm，熒光光譜掃描3D圖像，每隔5 nm掃描一次，激發(fā)波長(zhǎng)范圍400-600 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍500-900 nm。電泳均做考馬斯亮藍(lán)和醋酸鋅雙染，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的分離膠和濃縮膠濃度分別為14%和5%，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）的分離膠和濃縮膠濃度均為5%。

1.2.5 藻紅蛋白含量和產(chǎn)率計(jì)算 藻紅蛋白含量計(jì)算公式［15］：CPE＝ 0.123A565﹣ 0.068A615﹢ 0.015A650

1.2.6 摩爾消光系數(shù)測(cè)定 配制濃度為0、25、50、100、200、300和400 μg/mL的牛血清白蛋白，用Folin-酚法以A750吸收值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并取純度>5.0的藻紅蛋白溶液（10 mmol/L磷酸鈉，pH6.8）測(cè)定濃度，該溶液用紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定565 nm的吸收值，用Lambert-Beer定律A=CεL反推出565 nm波長(zhǎng)的摩爾消光系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白和樣品均做6個(gè)平行。

配制濃度為0、25、50、100、200、300、400和500 μg/mL的牛血清白蛋白，用Bradford法以A595吸收值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并取和上述同一純度的藻紅蛋白溶液測(cè)定濃度，該溶液測(cè)定565 nm的吸收值并反推出相應(yīng)摩爾消光系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白和樣品均做6個(gè)平行。

1.2.7 熒光量子產(chǎn)率測(cè)定 以溶于無水乙醇的5.0 μg/mL羅丹明B為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用參比法測(cè)定藻紅蛋白熒光量子產(chǎn)率。移取羅丹明B溶液與純度>5.0的藻紅蛋白溶液（A505nm<0.05），在紫外-可見分光光度計(jì)上測(cè)定其在505 nm處的吸光度。將上述溶液置于熒光比色皿中，在分子熒光光譜儀上分別掃描它們以505 nm為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)的熒光發(fā)射光譜，讀取相應(yīng)積分熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)做3個(gè)平行樣。用下述公式計(jì)算藻紅蛋白在505 nm的熒光量子產(chǎn)率：

Yp=Yr·Fp/Fr·Ar/ApYp、Yr—藻紅蛋白和羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率；Fp、Fr—為藻紅蛋白和羅丹明B的積分熒光強(qiáng)度；

Ap、Ar—為藻紅蛋白和羅丹明B在505 nm的吸光值

1.2.8 光漂白時(shí)間測(cè)定 96孔板中加入純度>5.0藻紅蛋白，蛋白梯度設(shè)為15、30、60、120和240 μg/mL，每孔100 μL。分別用日光燈、發(fā)光二極管、碘鎢燈和激光進(jìn)行照射，照射時(shí)間為10、30、60、120和240 min。另設(shè)藻紅蛋白60、120和240 μg/mL，每孔100 μL，用激光進(jìn)行照射，照射時(shí)間為10、20和30 min。照射結(jié)束后用酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液在490 nm吸收值，每孔均設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 蛋白釋放效果

經(jīng)過細(xì)胞破碎，獲得了8 000 mL溶液，其中含17 262 mg純度為0.54（A564/A280）藻紅蛋白。經(jīng)過4次硫酸銨鹽析，溶液中藻紅蛋白純度不斷提高，40%鹽析后蛋白純度達(dá)到1.67（A564/A280），含量為13 888 mg（表 1）。

表1 硫酸銨鹽析條斑紫菜藻紅蛋白粗提液的效果

2.2 蛋白層析效果

粗提液在純化時(shí)只過一次羥基磷灰石柱即可獲得純度＞4.0的藻紅蛋白2 234 mg，再過一次該柱可獲得純度＞4.5的藻紅蛋白2 172 mg（表2）。

2.3 蛋白純度鑒定

已純化的藻紅蛋白通過吸收/熒光激發(fā)光譜驗(yàn)證（圖1）顯示，純化的藻紅蛋白最大吸收峰為565 nm，498 nm處有一次峰，540 nm處有一吸收肩，最大熒光發(fā)射峰在575 nm。已純化的蛋白通過SDSPAGE和Native-PAGE的考馬斯亮藍(lán)/醋酸鋅雙染驗(yàn)證。蛋白α、β亞基分子量在14.4-20.1 kD之間，γ亞基在31 kD左右（圖2）。

表2 條斑紫菜藻紅蛋白通過羥基磷灰石層析的效果

圖1 條斑紫菜藻紅蛋白的吸收光譜圖（A）和熒光發(fā)射光譜圖（B）

圖2 條斑紫菜藻紅蛋白SDS-PAGE（A）和Native-PAGE（B）電泳鑒定圖譜

2.4 摩爾消光系數(shù)測(cè)定

條斑紫菜藻紅蛋白（10 mmol/L磷酸鈉，pH6.8）在565 nm的摩爾消光系數(shù)用Folin-酚法測(cè)定值為1.79 mL/（mg·cm），用Bradford法測(cè)定值為1.73 mL/（mg·cm）（圖3），兩者非常接近。

2.5 熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

以羅丹明B溶液在20℃時(shí)的量子產(chǎn)率0.97為參照，條斑紫菜藻紅蛋白20℃時(shí)在505 nm處的熒光量子產(chǎn)率為0.90。

2.6 光漂白時(shí)間測(cè)定

隨著光照時(shí)間的增加，PE在日光燈、發(fā)光二極管、碘鎢燈和激光4種光源下的光漂白效果以激光最顯著，240 μg/mL PE 10 min光漂白率可接近碘鎢燈輻照240 min的值，而PE濃度越高，同樣時(shí)間被漂白的蛋白絕對(duì)量越大，但即使經(jīng)過240 min的輻照，各種光源下蛋白在490 nm吸收值依然與自身濃度成正比（圖4）。

圖3 Folin-酚法（A）和Bradford法（B）測(cè)藻紅蛋白摩爾消光系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖4 條斑紫菜藻紅蛋白在日光燈（A）、發(fā)光二極管（B）、碘鎢燈（C）和激光下（D）的光漂白效果圖

3 討論

3.1 關(guān)于條斑紫菜藻紅蛋白規(guī)模純化

前人對(duì)于藻紅蛋白規(guī)模純化有不少研究［6-9］，以條斑紫菜為材料的最新方法是膨化柱法。Niu等［14］將28 g條斑紫菜破碎后，上清用phenyl-sepharose疏水層析，得到0.096%純度2.00-2.50的PE，再用DEAE-sepharose柱最終獲得0.082%純度4.50的PE。而本試驗(yàn)2 kg條斑紫菜在純化時(shí)只過一次羥基磷灰石柱即可獲得0.184%純度＞3.20的藻紅蛋白，再過一次該柱可獲得0.109%純度＞4.50的藻紅蛋白，省時(shí)省力。

對(duì)于本提取流程的機(jī)理，我們認(rèn)為可從以下方面解釋：首先，鹽析與疏水層析的原理相似，都是蛋白質(zhì)分子在高鹽環(huán)境下構(gòu)象改變，疏水基團(tuán)發(fā)生非共價(jià)聚合而與其他親水分子分離，多次鹽析效果類似于多次疏水層析；其次，脫鹽去除了過小的分子，效果類似于凝膠過濾層析；再次，羥基磷灰石具有獨(dú)特的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，目前已知其與蛋白質(zhì)的結(jié)合有4種作用機(jī)理：靜電作用，共價(jià)復(fù)合物的生成，排斥作用，以及電荷的幾何分布［21］。這4點(diǎn)的共同作用使得羥基磷灰石與其他介質(zhì)相比有了明顯的選擇性。最終使得條斑紫菜高純度藻紅蛋白的規(guī)模制備過程較為簡(jiǎn)捷。

3.2 關(guān)于本提純方法的經(jīng)濟(jì)效益

由于使用了廉價(jià)的經(jīng)濟(jì)海藻作為原料（條斑紫菜市價(jià)20元/kg），簡(jiǎn)單和低成本的粗提工藝（硫酸銨市價(jià)16元/kg），自制的羥基磷灰石層析填料，加之較高的蛋白產(chǎn)率和純度，使得本方法具有較高的經(jīng)濟(jì)效益及規(guī)模可持續(xù)擴(kuò)大的潛力。

4 結(jié)論

采用“溶脹+組織搗碎”法破碎2 kg凍干條斑紫菜葉狀體細(xì)胞，經(jīng)多次硫酸銨鹽析和一次羥基磷灰石層析后獲得純度>3.20的藻紅蛋白的產(chǎn)率為0.184%，再經(jīng)一次同樣層析可獲得純度>4.50的藻紅蛋白的產(chǎn)率為0.109%；條斑紫菜藻紅蛋白摩爾消光系數(shù)經(jīng)Folin-酚法和Bradford法測(cè)定分別為1.79 mL/（mg·cm）和 1.73 mL/（mg·cm）；20℃時(shí)，條斑紫菜藻紅蛋白在505 nm處的熒光量子產(chǎn)率為0.90；在日光燈、發(fā)光二極管、碘鎢燈和激光4種光源下的藻紅蛋白光漂白效果以激光最顯著，240 μg/mL藻紅蛋白10 min光漂白率可接近碘鎢燈輻照240 min的光漂白率。

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