劉 妮 李淑華 梁英杰 楊詩(shī)聰

（中山大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院病理科 廣州510080）

免疫組化技術(shù)在病理診斷中起著十分重要的作用，但前提是要有穩(wěn)定和高質(zhì)量的免疫染色結(jié)果［1］。然而免疫組化的染色過(guò)程比較復(fù)雜，影響染色結(jié)果的因素也很多［2］，所以設(shè)置免疫組化對(duì)照尤為重要。本實(shí)驗(yàn)研究在多種不同類(lèi)型的組織中找出合適的免疫組化陽(yáng)性對(duì)照及其相關(guān)制作方法。

材料和方法

1.材料

選取中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院送檢的闌尾、乳腺和扁桃體組織，10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片厚4μm。

2.方法

選取的組織通過(guò)HE染色觀察，根據(jù)合適相應(yīng)抗原表達(dá)的區(qū)域，將各組織切成0.3cm×0.3cm大小進(jìn)行再包埋，保證各組織包埋面含有相應(yīng)的組織成分，如闌尾組織應(yīng)含有粘膜層，粘膜下層，肌層和外膜等結(jié)構(gòu)。將闌尾、乳腺和扁桃體組織分成A、B、C三組，分別進(jìn)行36種抗體的全自動(dòng)免疫組化染色，其中標(biāo)記上皮相關(guān)抗原的抗體有CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、M－CEA、EMA，標(biāo)記肌源性抗原的抗體有SMA、HHF35、Calponin，標(biāo)記神經(jīng)來(lái)源的抗體有 Vimentin、S－100、NSE、CD56，標(biāo)記血管及淋巴管內(nèi)皮的抗體有 CD31、CD34、D2－40、FactorⅧ，淋巴瘤相關(guān)抗體有LCA、CD20、CD79a、CD3、CD5、CD10、CD21、CD23、CD4、CD8，乳腺癌標(biāo)記相關(guān)抗體有ER、PR、Ki67，組織細(xì)胞來(lái)源相關(guān)抗體有CD68，Mac387，AAT，AACT，Lyosozyme。

結(jié) 果

A組：闌尾組織中 CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、M－CEA、EMA在腺上皮胞漿呈陽(yáng)性（圖1）；SMA、HHF35、Calponin顯示為肌層肌纖維胞漿陽(yáng)性（圖2）；Vimentin顯示為間葉組織胞漿陽(yáng)性；S－100、NSE、CD56為肌層神經(jīng)纖維陽(yáng)性（圖3）；CD31、CD34粘膜下層血管內(nèi)皮陽(yáng)性；D2－40、FactorⅧ為淋巴管內(nèi)皮陽(yáng)性；LCA、CD20、CD79a、CD10淋巴細(xì)胞陽(yáng)性，CD21、CD23在固有層的淋巴小結(jié)濾泡生發(fā)中心的樹(shù)突狀細(xì)胞胞膜呈陽(yáng)性；CD3、CD4、CD5、CD8則在濾泡周?chē)牧馨图?xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)（圖4）。CD68、Mac387、Lyosozyme、AAT、AACT在粘膜下層散在的組織細(xì)胞胞漿陽(yáng)性；Ki67在淋巴小結(jié)濾泡中心顯示為細(xì)胞核陽(yáng)性。共34種抗體染色陽(yáng)性。

圖1 CK腺上皮胞漿陽(yáng)性10×圖2 Calponin平滑肌纖維胞漿陽(yáng)性10×圖3 S－100神經(jīng)纖維胞漿陽(yáng)性10×圖4 CD3濾泡周?chē)馨图?xì)胞胞膜陽(yáng)性20×圖5 免疫組化染色片F(xiàn)ig.1 Glandular epithelial cells show positive staining of CK in the cytoplasm.10×Fig.2 Smooth muscle fibers show positive staining of Calponin in the cytoplasm.10×Fig.3 Nerve fibers show positive staining of S－100 in the cytoplasm.10×Fig.4 Follicular peripheral lymphocytes show positive staining of CD3 in the cytomembrane.20×Fig.5 The slide of immunohistochemical staining

B組：乳腺組織中 CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、EMA 在 導(dǎo) 管 上 皮 呈 陽(yáng) 性；SMA、HHF35、Calponin顯示為肌上皮細(xì)胞和平滑肌纖維陽(yáng)性；Vimentin顯示為間葉組織胞漿陽(yáng)性；CD31、CD34血管內(nèi)皮陽(yáng)性；D2－40、FactorⅧ淋巴管內(nèi)皮陽(yáng)性；ER、PR、Ki67在導(dǎo)管上皮細(xì)胞核陽(yáng)性，其余為陰性染色。共17種抗體染色陽(yáng)性。

C組：扁桃體組織中CK、CK8／18、EMA在上皮細(xì)胞胞漿呈陽(yáng)性；血管肌層陽(yáng)性的有SMA、H HF35、Calponin，Vimentin顯示為間葉組織胞漿陽(yáng)性，CD31、CD34血管內(nèi)皮陽(yáng)性；D2－40、FactorⅧ淋巴管內(nèi)皮陽(yáng)性，LCA、CD20、CD79a、CD10、CD21、CD23在淋巴結(jié)濾泡生發(fā)中心顯示為淋巴細(xì)胞胞膜陽(yáng)性；CD3、CD4、CD5、CD8在濾泡周?chē)逼べ|(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)。共21種抗體染色陽(yáng)性。

討 論

免疫組織化學(xué)技術(shù)在病理診斷中是把雙刃劍，高質(zhì)量的免疫組化染色結(jié)果能輔助病理醫(yī)生更準(zhǔn)確地進(jìn)行病理診斷，提過(guò)病理診斷水平；但不當(dāng)?shù)拿庖呓M化染色結(jié)果可能會(huì)引起漏診和誤診甚至造成錯(cuò)誤的病理診斷，而免疫組織化學(xué)染色過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟的操作，每一個(gè)步驟操作不當(dāng)都會(huì)影響染色結(jié)果進(jìn)而影響病理診斷的準(zhǔn)確性［3］。特別是全自動(dòng)免疫組化機(jī)越來(lái)越普及，在使用全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色時(shí)，無(wú)從觀察到染色的全過(guò)程，如果出現(xiàn)切片上抗體量不足或有氣泡等現(xiàn)象也無(wú)法避免。因此，進(jìn)行免疫組化染色質(zhì)控，確保染色結(jié)果穩(wěn)定可靠十分重要。在染色過(guò)程中設(shè)立對(duì)照是進(jìn)行染色質(zhì)控的重要措施之一，能保證免疫染色過(guò)程中抗體試劑可靠，染色操作正確，避免試劑失效，操作失當(dāng)或機(jī)器故障引起假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。對(duì)照組織一般預(yù)先切片貼在載玻片中央保存，需要時(shí)再將待檢測(cè)組織切片貼在對(duì)照組織旁邊（圖5），使待檢測(cè)試組織片和對(duì)照片都在同一張玻片中，在相同的條件下，進(jìn)行免疫組化染色。在觀察染色結(jié)果時(shí)，應(yīng)首先觀察對(duì)照組織片的染色結(jié)果，通過(guò)對(duì)照片的結(jié)果來(lái)判斷該片免疫組化染色是否成功。如果對(duì)照片染色結(jié)果抗原表達(dá)正確，沒(méi)有非特異性染色，則該片中待檢測(cè)組織的染色結(jié)果就可靠，可用于病理診斷.如果對(duì)照片染色不當(dāng)，出現(xiàn)非特異性染色，那么該待檢組織片就不能用于診斷，需要找出染色不當(dāng)?shù)脑颍匦逻M(jìn)行染色。

目前，國(guó)內(nèi)外很多單位多使用組織芯片作為對(duì)照［4，5］。但組織芯片中有多個(gè)組織才能滿(mǎn)足幾十種抗體對(duì)照的需要，所占的面積較大，所需的抗體也較多，而且制作組織芯片麻煩，也經(jīng)常出現(xiàn)某一個(gè)組織掉片的現(xiàn)象，購(gòu)買(mǎi)商品化的組織芯片成本高［6］。本實(shí)驗(yàn)選取闌尾組織作為對(duì)照組織，較其他組織闌尾組織所包含的組織細(xì)胞種類(lèi)多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管等，大部分常用的抗體都分別在相應(yīng)的組織細(xì)胞中表達(dá)或不表達(dá)，因此最適合用于制作免疫染色的對(duì)照片。而且闌尾作為陽(yáng)性對(duì)照的制作方法也比較簡(jiǎn)便，正常闌尾管腔小，只需將呈管狀組織的闌尾組織，沿管徑切成0.3cm×0.3cm大小的扇形闌尾，使其含有粘膜層、粘膜下層、肌層和外膜，保證組織含有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管等組織細(xì)胞，再包埋成0.4cm×0.4cm大小的組織蠟塊。這樣制作對(duì)照片，標(biāo)本來(lái)源容易，制作簡(jiǎn)單，可節(jié)約人力、物力，也十分適合基層醫(yī)院開(kāi)展工作。

用作對(duì)照的組織蠟塊和石蠟切片，不適宜長(zhǎng)期保存，因存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織抗原的保存受到一定的影響，抗原活性會(huì)有所降低，因此組織蠟塊保存于數(shù)月后應(yīng)放棄使用，重新找新的組織制作蠟塊，而闌尾組織較容易獲得，材料來(lái)源十分方便。另外切好的對(duì)照片一般在室溫晾干過(guò)夜，此時(shí)，組織蠟片沒(méi)有熔開(kāi)，可保存長(zhǎng)一些時(shí)間，待貼上待檢測(cè)組織片時(shí)，再一起烤片。切片的數(shù)量按平時(shí)的工作量作為依據(jù)，一般可供使用一星期為佳，不宜大量切片，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間保存。闌尾組織作為對(duì)照組織也有一定局限性，對(duì)于某些抗體染色，闌尾組織并都不適用，需要另外選取相應(yīng)的對(duì)照組織片，如ER、PR等抗體染色的陽(yáng)性對(duì)照，則應(yīng)選用含正常導(dǎo)管上皮的乳腺導(dǎo)管癌組織片做對(duì)照。

綜所上述，我們認(rèn)為闌尾組織較其他單一組織，可用于更多種抗原的染色對(duì)照，較組織芯片制作更簡(jiǎn)單，操作更方便，成本更低，所耗費(fèi)的試劑更少，因此最適合用來(lái)制作免疫組化染色的質(zhì)控對(duì)照片，值得推廣使用。

［1］李麗華，病理免疫組化染色方法質(zhì)量控制應(yīng)注意的問(wèn)題.局解手術(shù)學(xué)雜志，2008，（06）：434－435

［2］李德本，王濤，姜駿.免疫組化染色的操作技巧和注意事項(xiàng).臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，（11）：1260－1261

［3］梁英杰，凌啟波，張威.臨床病理學(xué)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社.2011：292

［4］劉衛(wèi)平等，組織芯片技術(shù)及其在病理學(xué)研究中的初步應(yīng)用.中華病理學(xué)雜志，2002，（02）：83－84

［5］Sallinen SL.Identification of differentially expressedgenes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques.Cancer Res，2000，60（23）：6617－6622

［6］景青萍，張建中，鄭燕華，等.微組織芯片在免疫組化染色對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用.診斷病理學(xué)雜志，2005，（02）：154－155