田 野 徐 瑩 付 勤

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科，1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽110004）

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨贅形成為特征的退變性疾病，患肢關(guān)節(jié)經(jīng)常出現(xiàn)嚴重的疼痛，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能降低，對病人的生存質(zhì)量造成明顯的影響［1］。近幾年的研究表明，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞和骨骺軟骨生長板內(nèi)的細胞一樣，都要經(jīng)歷終末期成熟分化的過程［2］；對于骨關(guān)節(jié)炎的治療，則以抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的病理生理過程，即以抑制其終末期成熟分化為基礎(chǔ)［3］。本研究以新生小鼠胸骨軟骨細胞為細胞模板，探索甲狀旁腺素（PTH）是否對其具有促進成軟骨和抑制其終末期成熟分化的作用。

材料和方法

1.實驗動物和主要試劑

昆明新生小鼠（出生4日內(nèi)，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供）；1－34重組人甲狀旁腺素（Sigma公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；標準胎牛血清（FBS，Hyclone）；鏈霉蛋白酶和二型膠原酶（上海艾研生物科技有限公司）；Alcian藍染色試劑（Sigma公司）；ALP 染色 one－step試劑（Pierce 公司）；RNeasy試劑盒（Qiagen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen 公 司）；SYBR Green（Applied Biosystems公司）；ALP兔抗鼠單克隆抗體（santa cruz biotechnology公司）；Runx2兔抗鼠單克隆抗體（abcam公司）；Sox9和Aggrecan兔抗鼠單克隆抗體（santa cruz biotechnology公司）；β－actin兔抗鼠單克隆抗體（Sigma公司）。

2.方法

2.1 細胞分離和培養(yǎng)：分離新生小鼠的胸骨和肋骨，PBS沖洗1次，加入鏈霉蛋白酶（2mg／ml），37℃水浴震蕩1h；PBS沖洗3次，加入二型膠原酶（3mg／ml），37℃水浴震蕩1h；PBS沖洗3次，將消化剩余物移入表面皿中，再次加入二型膠原酶（3mg／ml），置于孵育箱內(nèi)4－6h，每隔1h震蕩一次；通過0.7μm過濾器過濾，收集濾過液，1200rpm離心5m，收集沉淀，重懸細胞，將細胞種植于6孔或12孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞分組和處理：將細胞分為兩組：鹽水對照組和PTH處理組，于種植后24h，開始用生理鹽水或PTH（100n M）每日處理細胞。每日觀察細胞形態(tài)，并于第3－7日間，每日收集細胞進行染色、RT－PCR和Westernblot等實驗。

2.3 Alcian藍染色：吸除細胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，于室溫下以10%中性福爾馬林固定細胞20min；吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入Alcian藍染色劑（p H2.5），室溫下孵育2h；吸除染色劑，70%乙醇清洗細胞2次，去離子水清洗細胞3次，室溫下自然干燥過夜。

2.4 堿性磷酸酶（ALP）染色：吸除細胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，于室溫下以10%中性福爾馬林固定細胞15min；吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入ALP one－step染色劑，于37℃孵育45min；吸除染色劑，PBS清洗2次，室溫下自然干燥過夜。

2.5 RNA 提 取 和 實 時 RT－PCR（Real－time RT－PCR）：用RNeasy試劑盒提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后稀釋3倍，取1μl稀釋后的cDNA進行實時PCR反應(yīng)。特異性小鼠引物序列如下：ALP：Sense：TGACCTTCTCTCCTCCATCC，Antisense：CTTCCTGGGAGTCTCATCCT； Runx2：Sense： GGAATGATGAGAACTA，Antisense：ACCGTCCACTGTCACTTT；Sox9：Sense：CTAATGCTATCTTCAAGGCGCTGC， Antisense： CTCGCTTCAGATCAACTT TGCCAG；Aggrecan：Sense：CGTGTTTCCAGAGAAAAGGA， Antisense：TGTGCTCGATCAAAGTCCAG；β－actin：Sense：AGATGTGGATCAGCAAGCAG； Antisense：GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA.反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15min后，95℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共45個循環(huán)，于72℃延伸階段檢測熒光產(chǎn)物，生成擴增曲線。在同一次反應(yīng)中，各組均設(shè)3個平行重復(fù)。以β－actin為內(nèi)參基因，通過Rotor Gene分析軟件進行定量分析。

2.6 Western Blot檢測蛋白：以Golden lysis buffer液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每泳道上樣40μg，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入一抗（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜后，加入二抗（1∶3000）室溫下孵育1h。以β－actin為內(nèi)參基因，Supersignal west Pico試劑孵育10分鐘，曝光20s，照相并分析。

3.統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)以均數(shù)＋標準差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析；當P＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.新生小鼠胸骨軟骨細胞的分化特征

未經(jīng)處理的新生小鼠胸骨軟骨細胞的ALP染色強度逐漸增強 （圖1）；成軟骨因子基因表達逐漸減弱，促病理性肥大基因表達逐漸增強（圖2）。以上結(jié)果表明，新生小鼠胸骨軟骨細胞具有自發(fā)性成熟分化的特點。

2.PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞形態(tài)學的影響

未經(jīng)處理的新生小鼠胸骨軟骨細胞于種植后24小時貼壁生長，于5天達到80%－90%融合，之后細胞開始逐漸失去軟骨細胞形態(tài)。但與對照組相比，經(jīng)PTH處理后，于5－7天細胞融合后，細胞仍更多的保持軟骨細胞形態(tài) （圖3）。

3 PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞Alcian藍染色和ALP染色的影響

對照組新生小鼠胸骨軟骨細胞Alcian藍染色強度，隨培養(yǎng)時間逐漸減弱；經(jīng)PTH處理組染色強度，隨時間逐漸增強，且于第5、6和7日，與對照組相比，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖4）。兩組新生小鼠胸骨軟骨細胞ALP染色強度，均隨時間逐漸增強，但PTH組與對照組相比增強緩慢，于第5、6和7日，PTH明顯降低了ALP的染色強度，二者比較，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖5）。

4.PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞成軟骨和促病理肥大因子基因m RNA表達的影響

對照組和PTH組新生小鼠胸骨軟骨細胞Sox9和Aggrecan基因的表達，均隨時間逐漸下降；但在每一時間點，與對照組相比，PTH均明顯提高細胞內(nèi)Sox9和Aggrecan基因的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，兩組細胞內(nèi)ALP和Runx2基因的表達，均隨時間逐漸升高，但與對照組相比，PTH組ALP和Runx2基因表達升高幅度較緩，在每一時間點，PTH均明顯降低二基因的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖6）。

5.PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞成軟骨和促病理肥大因子蛋白表達的影響

與其基因表達一致，與對照組相比，PTH顯著提高細胞內(nèi)Sox9和Aggrecan蛋白的表達，顯著降低細胞內(nèi)ALP和Runx2蛋白的表達（圖7）。

討 論

人類甲狀旁腺素（PTH）是含有84個氨基酸的多肽蛋白，具有調(diào)節(jié)血鈣、血磷，維持細胞外液內(nèi)環(huán)境的重要作用，其人工合成體PTH（1－34），含有34個PTH N端氨基酸序列相似分子片段，這一部分能夠與PTH受體結(jié)合而發(fā)揮相同的生物學作用［4－6］。在體實驗表明，PTH（1－34）能夠抑制大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎疾病的進展，但是具體的細胞學機制不甚明了［7］。

本研究表明，新生小鼠的胸骨軟骨細胞具有自發(fā)性成熟分化的特征，正如前述，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞也具有向終末期成熟分化的特征。因此新生小鼠胸骨軟骨細胞的部分生物學特征與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞極為相似，我們以此為依據(jù)，探索PTH（1－34）是否對離體軟骨細胞具有抑制終末期分化的作用。

近年來的研究結(jié)果證實，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞經(jīng)歷了終末期、病理肥大分化和基質(zhì)分泌減少的病理生理過程［8］。對于骨關(guān)節(jié)炎的治療研究，可以基于抑制軟骨細胞終末期、病理肥大分化和促進軟骨細胞基質(zhì)形成兩方面［9］。在骨關(guān)節(jié)炎細胞中，促成熟分化因子和部分酶類，如堿性磷酸酶（ALP）、X型膠原（Col10）和MMP等的表達，明顯增高；成軟骨因子，如Ⅱ型膠原（Col2）和Aggrecan等的表達，則明顯減低。在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄因子Sox9和Runx2在調(diào)控軟骨細胞增生和分化的方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。Sox9是軟骨細胞增生和成軟骨因子，如Col2、Aggrecan等合成的重要調(diào)節(jié)因子；Runx2則是軟骨細胞終末期、病理肥大分化的關(guān)鍵啟動因子，在骨關(guān)節(jié)炎的病理生理過程中起著關(guān)鍵性的作用［10－12］。

我們的研究結(jié)果顯示，PTH明顯增強Alcian藍染色的強度，降低ALP染色的強度，表明PTH一方面增強了軟骨細胞中軟骨基質(zhì)－蛋白多糖的合成，另一方面則起到抑制堿性磷酸酶合成的作用，而后者是軟骨細胞終末期分化的重要標志性蛋白。另外，RT－PCR和 Westernblot結(jié)果顯示，無論在m RNA水平，或是蛋白水平，PTH均顯著提高成軟骨因子Sox9和Aggrecan的表達，降低病理性肥大分化因子Runx2和ALP的表達。

綜上所述，PTH能夠直接促進軟骨細胞的成軟骨作用，抑制軟骨細胞的終末期成熟分化，本研究為PTH抑制骨關(guān)節(jié)炎疾病的進展，在細胞學水平提供了一定的依據(jù)。

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圖 版 說 明

圖1 新生小鼠胸骨軟骨細胞ALP染色強度的變化

圖2 新生小鼠胸骨軟骨細胞成軟骨因子和促病理性肥大因子基因mRNA表達的變化

圖3 PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞形態(tài)學的影響

圖4 PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞Alcian藍染色的影響?！颬＜0.05

圖5 PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞ALP染色的影響?！颬＜0.05

圖6 PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞細胞因子mRNA表達的影響。★P＜0.05

圖7 PTH對新生小鼠胸骨軟骨細胞細胞因子蛋白表達的影響

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 ALP staining of mouse sternal chondrocytes

Fig.2 Chondrogenic and hypertrophic marker genes m RNA expression of mouse sternal chondrocytes

Fig.3 Morphology changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment

Fig.4 Alcian blue staining changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment，★denotes statistical significance from controls（P＜0.05）

Fig.5 ALP staining changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment，★denotes statistical significance from controls（P＜0.05）

Fig.6 Marker genes expression of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment，★denotes statistical significance from controls（P＜0.05）

Fig.7 Westernblot changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment