向葉宸 楊 潔 穆 慶 陳利軍 蔡鵬程 葉 紅 馬萬(wàn)里

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，1附屬協(xié)和醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，武漢430022；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系；衛(wèi)生部呼吸系疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430030）

間隙連接是細(xì)胞間直接進(jìn)行信息交流的唯一膜通道結(jié)構(gòu)。CX43是間隙連接中分布最廣、研究最多的間隙連接分子。CX43與眾多的蛋白發(fā)生相互作用，從而在間隙連接蛋白的組裝、運(yùn)輸、膜定位、間隙連接通道的形成以及對(duì)間隙連接通訊的調(diào)控等一系列過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用。CX43在肺內(nèi)各種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在I型和II型上皮細(xì)胞的連接中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肺血管內(nèi)皮表達(dá)的CX43在炎癥細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，說(shuō)明其具有促炎作用［1］。在急性肺損傷時(shí)CX43蛋白是上調(diào)的［2，3］，但特發(fā)性肺纖維化病人肺成纖維細(xì)胞晚期肺纖維化階段CX43表達(dá)是下調(diào)的［4］。促纖維化因子TGF－β1可上調(diào)CX43和下調(diào)CX37而引起纖維化［5］。最近的報(bào)道提示CX43通過(guò)間隙連接通道的形成而增加細(xì)胞對(duì)毒性物質(zhì)的敏感性［6］。

腫瘤化療藥物博萊霉素可導(dǎo)致肺纖維化及胸膜纖維化，其發(fā)病機(jī)制與早期的炎癥浸潤(rùn)和晚期的細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)。在早期炎癥階段，T淋巴細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及骨髓來(lái)源的纖維細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)入肺泡間質(zhì)，從而釋放炎癥因子及促纖維化因子如TGF－β等。炎癥細(xì)胞是否能夠游離到肺間質(zhì)中則與血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙連接的功能狀態(tài)有關(guān)，其中間隙連接蛋白對(duì)間隙連接功能調(diào)節(jié)起主要作用。

博萊霉素可誘導(dǎo)肺纖維化，但是在動(dòng)物胸腔內(nèi)單純注射博萊霉素難以觀察到典型的胸膜纖維化，本文使用博萊霉素加碳粉復(fù)制小鼠胸膜纖維化模型，檢測(cè)CX43在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)表達(dá)，以研究CX43的表達(dá)變化與胸膜纖維化發(fā)展進(jìn)程的關(guān)系。

材料和方法

1.模型復(fù)制

小鼠胸膜纖維化模型的復(fù)制采用Decologne等的方法［7］。將成年C57BL／6J小鼠（購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，雌性，體重15±2g）隨機(jī)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組（F2、F7、F21）和三個(gè)對(duì)照組（C2、C7、C21），每組5只。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠經(jīng)肋間隙一次性胸膜腔給予0.2ml含0.07μg博萊霉素（bleomycin）和1 mg碳粉（carbon）的生理鹽水，對(duì)照組給予0.2ml生理鹽水，分別于第2d（F2組和C2組）、第7d（F7組和C7組）和第21d（F21組和C21組）處死動(dòng)物，取出肺及胸膜組織，10%中性甲醛溶液固定。

2.Masson染色檢測(cè)膠原纖維含量

固定的肺及胸膜組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)Masson三聯(lián)染色檢測(cè)膠原纖維的含量。

3.免疫組化染色檢測(cè)CX43蛋白的表達(dá)

取石蠟切片，60℃烤2 h，二甲苯脫蠟，酒精梯度入水，PBS 洗3 min×3 次；0.3%Triton X－100室溫孵育20 min；3%H2O2室溫孵育15 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；10%山羊血清 封閉，室溫30 min；甩去多余液體，不洗；加入1∶100稀釋的羊抗鼠CX43親和純化多克隆抗體，4℃過(guò)夜，0.01 mol／L PBS洗5 min×3次；滴加生物素化兔抗羊IgG，37℃45 min。0.01 mol／L PBS洗5 min×3次；滴加SABC 試劑，37℃20 min；0.01 mol／L PBS 洗5 min×4次；DAB顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片；顯微圖像分析。

4.圖像分析及統(tǒng)計(jì)處理

免疫組化在400倍視野下，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)肺邊緣靠近胸膜的視野，用Image Pro－Plus顯微圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)定陽(yáng)性顆粒的平均吸光度值（A值），進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)用mean±SD表示，采用均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.Masson染色顯示博萊霉素和碳粉引起各組小鼠胸膜膠原沉積

Masson染色結(jié)果顯示，博萊霉素和碳粉處理的小鼠中，第2d胸膜即明顯增厚，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并有膠原纖維沉積；第7d胸膜增厚達(dá)到高峰，膠原明顯增多；第21d膠原含量進(jìn)一步增多，但胸膜厚度較前減少。提示博萊霉素加碳粉確實(shí)引起了胸膜纖維化，早期表現(xiàn)為胸膜炎，晚期表現(xiàn)為胸膜纖維化（見(jiàn)圖1）。

2.免疫組化染色顯示的胸膜組織CX43蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)

CX43免疫組化染色結(jié)果顯示，博萊霉素和碳粉刺激的小鼠中，隨著病程進(jìn)展，胸膜纖維化小鼠胸膜間皮細(xì)胞CX43表達(dá)呈現(xiàn)先逐漸增加后遞減的趨勢(shì)，并且末期胸膜間皮細(xì)胞CX43表達(dá)量低于早期。如圖2所示，胸膜組織CX43的表達(dá)的光密度值各實(shí)驗(yàn)組始終高于其各自對(duì)照組，且有顯著性差異（P＜0.05）。在實(shí)驗(yàn)組中，第2d組小鼠的胸膜CX43表達(dá)的光密度值略低于第7d組小鼠，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。而第7d組小鼠的胸膜CX43表達(dá)的光密度值略高于第21d組小鼠，有顯著性差異（P＜0.05）。提示博萊霉素和碳粉的刺激可導(dǎo)致CX43蛋白表達(dá)增加，第7dCX43表達(dá)增加程度最大（見(jiàn)圖2）。

圖1 博萊霉素和碳粉引起的小鼠胸膜膠原沉積（Masson三聯(lián)染色，藍(lán)色為膠原纖維，標(biāo)尺＝100μm）圖2 博萊霉素和碳粉引起小鼠胸膜組織CX43動(dòng)態(tài)表達(dá)（免疫組化染色，棕色為陽(yáng)性顆粒，＊與對(duì)照比較，＃與第7d博萊霉素和碳粉組比較）Fig.1 Bleomycin and carbon particles induced pleural collagen deposition in C57BL／6J mice.（Masson staining，bar＝100μm）Fig.2 Bleomycin and carbon particles induced dynamic up－regulation of pleural CX43 protein expression.（Immunohistochemistry staining，bar＝100μm.＊compared with control，＃compared with bleomycin＋carbon of 7th day）.

討 論

博萊霉素常用于復(fù)制肺纖維化模型，但是在動(dòng)物胸腔內(nèi)單純注射博萊霉素難以觀察到典型的胸膜纖維化，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用博萊霉素加碳粉復(fù)制胸膜纖維化模型［7］，胸膜組織經(jīng)歷了從早期的急性胸膜炎到晚期的纖維化階段，膠原纖維含量逐漸增加，胸膜壁明顯增厚，說(shuō)明胸膜纖維化模型復(fù)制成功。

間隙連接參與炎癥反應(yīng)的多個(gè)過(guò)程，包括抗原提呈、趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、炎癥細(xì)胞的遷移、粘附和活化。CX43是廣泛表達(dá)的構(gòu)成間隙連接中的間隙連接分子，有研究表明，CX43在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，隨著炎癥的產(chǎn)生組織中CX43的表達(dá)增加，急性肺損傷可導(dǎo)致其上調(diào)［1－3］。在星形膠質(zhì)細(xì)胞，IL－1β和 TNF－α的混合物可活化CX43通道，而阻斷其活性可減輕神經(jīng)損傷［8］。CX43通過(guò)半通道的形成而改變細(xì)胞的氧化狀態(tài)從而增加細(xì)胞對(duì)鎘的細(xì)胞毒性的敏感性［6］。在肺組織，LPS可誘導(dǎo)CX43的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引起中性粒細(xì)胞向氣道的募集，抑制CX43可抑制炎癥的程度［9］。用CX43的反義寡核苷酸阻斷CX43的作用可減輕炎癥反應(yīng)［10，11］。放射線照射可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞CX43蛋白表達(dá)增加，其磷酸化亦增加［3］。但CX43在胸膜炎時(shí)的表達(dá)變化及其與胸膜纖維化形成的關(guān)系目前未見(jiàn)報(bào)道。

為研究CX43在胸膜纖維化發(fā)病進(jìn)程中的作用，我們檢測(cè)了CX43蛋白的原位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CX43蛋白的表達(dá)與炎癥程度明顯相關(guān)，在第2d即有明顯上調(diào)，第7d達(dá)高峰，21d稍有所降低，但仍高于對(duì)照組。纖維化的早期伴隨的是胸膜炎癥的發(fā)生，因此胸膜間皮細(xì)胞CX43表達(dá)先增加可能與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，炎癥越嚴(yán)重CX43的表達(dá)越高。模型早期由于炎癥反應(yīng)強(qiáng)，導(dǎo)致胸膜間皮細(xì)胞表達(dá)大量的CX43，而隨著炎癥的消退和胸膜纖維化的產(chǎn)生導(dǎo)致胸膜間皮細(xì)胞CX43的表達(dá)量逐漸減少，晚期由于纖維化的形成，CX43的表達(dá)進(jìn)一步降低，但仍高于對(duì)照組。提示CX43參與博萊霉素和碳粉引起的胸膜纖維化的發(fā)病進(jìn)程，而且在早期炎癥階段作用更明顯。

炎癥導(dǎo)致CX43上調(diào)的機(jī)制目前尚不清楚，有報(bào)道提示細(xì)胞因子IL－1β、TNF－α以及LPS通過(guò)上調(diào)iNOS進(jìn)而使NO產(chǎn)生增多而導(dǎo)致CX43表達(dá)增加［12－14］。CX43在纖維化的發(fā)病機(jī)制中的作用尚存在不同的意見(jiàn)，CX43－／－／CX40－／－的老年小鼠出現(xiàn)明顯的肺功能異常，表現(xiàn)為纖維化的增加，異常的肺泡重建以及肺內(nèi)成纖維細(xì)胞的增多，并有心肌肥大和高血壓［15］，提示CX43與纖維化的關(guān)系與年齡等因素密切相關(guān)。

綜上所述，在博萊霉素加碳粉引起的小鼠胸膜纖維化模型胸膜組織CX43蛋白表達(dá)增加，尤其在早期炎癥階段CX43表達(dá)增加更為明顯，CX43是通過(guò)促進(jìn)胸膜炎癥而在胸膜纖維化的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

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