摘要：以大別山地區(qū)野生蕙蘭（Cymbidium faberi）的花芽和花莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，考察了1 g/L HgCl2消毒時(shí)間對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)愈傷組織的激素濃度組合。結(jié)果表明，外植體用1 g/L HgCl2消毒8 min，接種成活率最高；激素濃度組合2 mg/L 2，4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA培養(yǎng)基最有利于外植體的增重；2 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA有利于誘導(dǎo)花莖和花芽外植體愈傷組織的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：野生蕙蘭（Cymbidium faberi）；愈傷組織誘導(dǎo)；激素；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S682.31；S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5505-03

Optimization of the Callus Induction Conditions of Wild Cymbidium faberi in Dabie Mountain Area

HUANG Jiang，LIAO Si-hong，F(xiàn)ANG Yuan-ping，ZHANG Pei，ZHAO Na，XIANG Jun

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization/College of Chemistry and Life Sciences， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： Flower buds and flower stems of Cymbidium faberi were used as explants for callus induction. The effect of 1 g/L HgCl2 disinfecting time on explants was studied. And the combination of plant hormones in medium was optimized by orthogonal design. The results showed that the explants had the highest survive rate when disinfected in 1 g/L HgCl2 for 8 min. The best plant hormone combination for weight increase of explants was 2.0 mg/L 2， 4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA， for callus induction of both flower buds and flower stems explants was 2.0 mg/L 2， 4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA.

Key words： wild Cymbidium faberi； callus induction； hormone； orthogonal design

蕙蘭（Cymbidium faberi）為蘭科（Orehidaceae）蘭屬（Cybidum Sw.）多年生草本花卉，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。近年來由于人們的過度追捧和開采，大量野生蘭花資源被濫挖亂采，遭到嚴(yán)重破壞，盡快實(shí)現(xiàn)蘭花的人工培育以代替野生資源十分重要[2]。利用生物技術(shù)手段對(duì)蘭花進(jìn)行人工培育將對(duì)中國蘭花的培養(yǎng)、研究和市場(chǎng)開拓起到重要的作用[3]。目前國蘭的組培快繁技術(shù)仍然是制約國蘭產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵[4-7]。本研究應(yīng)用大別山野生蕙蘭花芽和花莖作為組織培養(yǎng)的外植體，采用正交設(shè)計(jì)篩選出利于蕙蘭愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的激素濃度組合，為蕙蘭離體快繁和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大別山野生蕙蘭是早春開花的蘭花，于秋末分株栽培最佳。于2009年10月在湖北省黃岡市賈廟大崎山挖回少量蕙蘭植株并栽培，秋季為蘭花發(fā)芽拔箭期，栽培中要注意保持濕度，施肥宜稀忌濃，以放置1 d的洗米水澆灌為宜，每隔15 d施肥1次。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理 剪下幼嫩的花葶（長(zhǎng)度短于8 cm），分離花莖和花芽，在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，用1 g/L HgCl2對(duì)外植體表面進(jìn)行消毒，處理時(shí)間分為4、6、8、10 min。每個(gè)處理分別接種30個(gè)外植體。用已消毒的吸水紙將材料表面的水吸干。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 將已消毒的花莖切成長(zhǎng)4 mm的小段，每個(gè)花芽和花莖再縱切為4塊，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，先避光24 h以避免褐化，然后每天光照12 h。采用三因素四水平正交試驗(yàn)考察2，4-D、6-BA和NAA濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率和外植體增重的影響，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。每瓶接種6個(gè)外植體，每處理5瓶，觀察并統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成活率，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果。接種前稱量花莖外植體的質(zhì)量，待愈傷組織完全形成且外植體的體積不再增大時(shí)取出稱重，計(jì)算外植體的增重幅度。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/成活的外植體個(gè)數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 HgCl2消毒時(shí)間對(duì)接種效率的影響

用1 g/L的HgCl2對(duì)花莖和花芽外植體進(jìn)行消毒處理，消毒時(shí)間不同，外植體的污染率、死亡率和成活率有較大差異。表2顯示，對(duì)花莖和花芽外植體，污染率均隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而死亡率均隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，可見1 g/L的HgCl2消毒時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致滅菌不充分，而消毒時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成外植體細(xì)胞的損傷，消毒時(shí)間為8 min時(shí)花莖和花芽外植體的成活率均為最高。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

蕙蘭花莖和花芽外植體能夠形成兩種愈傷組織，一類為疏松愈傷組織，多由花芽外植體形成，淡黃綠色，表面凹凸不平，隨著培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)，在固體培養(yǎng)基上逐漸白化死亡（圖1）；另一類為致密愈傷組織，多由花莖外植體形成，深綠色，表面較光滑，肥厚，中間向外拱起，結(jié)構(gòu)致密，較堅(jiān)硬，分化率高于疏松愈傷組織（圖2）。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，由極差分析可知對(duì)花莖外植體的平均增重幅度影響最大的是2，4-D濃度，其次是NAA濃度，6-BA濃度影響最小；方差分析表明2，4-D對(duì)花莖外植體增重幅度的影響達(dá)極顯著水平（P<0.01），6-BA和NAA濃度的影響不顯著（P>0.05）。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果，花莖外植體增重的最佳試驗(yàn)組合為A3B4C4，即2 mg/L 2，4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA。對(duì)花莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大的是6-BA濃度，其次是2，4-D濃度，均達(dá)到顯著水平（P<0.05），NAA對(duì)花莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不顯著?；ㄇo外植體愈傷組織誘導(dǎo)的最佳試驗(yàn)組合為A3B3C4，即2 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA。對(duì)花芽外植體愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大的是NAA濃度，達(dá)到極顯著水平（P<0.01），2，4-D濃度和6-BA對(duì)花芽外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的影響達(dá)顯著水平（P<0.05）?；ㄑ客庵搀w愈傷組織誘導(dǎo)的最佳試驗(yàn)組合也為A3B3C4。

3 小結(jié)與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物組織和細(xì)胞的增殖、分化起著關(guān)鍵的作用。正交設(shè)計(jì)是多因素分析的有力工具[8-10]，該方法可以精簡(jiǎn)試驗(yàn)次數(shù)，克服在培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)上的盲目性，大大提高工作效率和試驗(yàn)的可靠性，目前已經(jīng)普遍應(yīng)用于植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中。此次研究采用三因素四水平正交設(shè)計(jì)，在綜合評(píng)定的基礎(chǔ)上篩選出了適合誘導(dǎo)蕙蘭花莖愈傷組織誘導(dǎo)的激素配比。

在參試的3種激素中，2，4-D對(duì)外植體質(zhì)量的增加和愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著的影響；6-BA對(duì)兩種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著影響。最有利于促進(jìn)外植體生長(zhǎng)的激素配比為2 mg/L 2，4-D+4.5 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA，最適于花莖和花芽外植體產(chǎn)生愈傷組織的激素配比為2 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+6 mg/L NAA。

目前國蘭的快繁問題依然是制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]，一方面是由于蘭花的無性繁殖容易染菌，不利于優(yōu)良品質(zhì)的遺傳，另一方面是由于蘭花的莖為根狀莖或是原球莖，葉片比較硬，芽極小且容易變長(zhǎng)成老葉，組織培養(yǎng)的取材非常有限。有學(xué)者以新長(zhǎng)出來的原球莖為材料，不僅材料少而且極易使受創(chuàng)傷的植株染菌。有學(xué)者嘗試以花梗作為蘭花組織培養(yǎng)的外植體，在單莖性蘭花的組培中的應(yīng)用較多[6]，何子育等[10]曾以蝴蝶蘭花梗為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)并取得了成功。本研究利用蕙蘭的花芽和花莖作為外植體成功地誘導(dǎo)出了愈傷組織。

愈傷組織的形成是建立無性繁殖體系非常關(guān)鍵的一步[11，12]，此次研究中發(fā)現(xiàn)，蕙蘭愈傷組織的繼代培養(yǎng)有一定的困難，主要問題是切割以后的愈傷組織容易褐化死亡，是下一步研究需要重點(diǎn)克服的難題，從而在愈傷組織繼代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)生根、成苗，以建立蕙蘭完整的無性繁殖體系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳心啟，羅毅波.中國蘭科植物研究的回顧和前瞻[J].植物學(xué)報(bào)，2003，45（S）：2-20.

[2] 孔凡龍，柴明良，徐曉薇.國蘭離體培養(yǎng)的回顧與展望[J].山東林業(yè)科技，2008（2）：69-71.

[3] 蔣 彧，葉蘭香，何俊蓉，等.生物技術(shù)在國蘭中的應(yīng)用[J].四川林業(yè)科學(xué)，2010，31（4）：103-105.

[4] 秦賀蘭.國蘭研究與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J].北京園林，2005，21（2）：20-24.

[5] 田 甜，朱 泉，何衛(wèi)星，等. 國蘭組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（8）：105-109.

[6] 詹忠根.蕙蘭屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].北方園藝，2006（3）：120-122.

[7] 陳 麗，潘瑞熾，陳汝民.墨蘭原球莖生長(zhǎng)的研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)[J]，1999，7（1）：59-64.

[8] 黃閩敏，劉曉芳，曹青爽.寒蘭組培苗生根培養(yǎng)的多因子正交試驗(yàn)研究[J].北方園藝，2009（4）：53-55.

[9] 呂曉輝，黃象男，郭曉慧，等.蝴蝶蘭愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（25）：8068-8070.

[10] 何子育，黃勇芳，屈秀蘭.蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)[J].熱帶作物科技，1999（5）：26-27.

[11] 朱至清.植物細(xì)胞工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.28-29.

[12] CHANG C， CHANG W C. Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var. misericors[J]. Plant Cell Reports，1998，17（4）：251-255.

（責(zé)任編輯 向 闈）