摘要：分別以野生牛大力（Milletia speciosa）成熟種子、帶芽莖段為材料研究不同激素組合及外植體的離體培養(yǎng)效果。結(jié)果表明，1 g/L HgCl2對(duì)牛大力種子和帶芽莖段分別消毒10 min和15 min效果最好；愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合為1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA，種子和帶芽莖段外植體的最高不定芽誘導(dǎo)率分別為95.8%和45.8%；最適合不定芽分化的激素組合為2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA，最高分化率為58.3%；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率高達(dá)70.8%；最佳移栽基質(zhì)為等體積混合的黃土、泥炭和河沙，移栽90 d后成活率為73.3%。

關(guān)鍵詞：牛大力（Milletia speciosa）；離體培養(yǎng)；種子；帶芽莖段；愈傷組織；移栽

中圖分類號(hào)：R282.71；S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5499-04

Study on in vitro Culture and Plant Regeneration of Milletia speciosa

WEI Ying，MA Xiao-jun，DONG Qing-song，WEI Kun-hua，LI Cui，BAI Long-hua

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant/Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Conservation and Genetic Improvement，

Nanning 530023， China）

Abstract： Using seeds and stems with buds of wild Milletia speciosa as material， the effects of different hormone combination and explants on the in vitro culture were investigated. The result showed that the optimum treatment time of 1 g/L HgCl2 for seed and stem was 10 and 15 min respectively. The best hormone combination for callus and adventitious buds induction was 1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA， the highest callus induction rate of seeds and adventitious buds of stem with a bud was 95.8% and 45.8%， respectively. The best medium for differentiation of adventitious bud was 2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA； the differentiation rate was 58.3%. And the best rooting medium was 1/2MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA； the rooting rate was 70.8%. The best matrix was mixture of equivalent volume of loess， peat and river sand， the survival rate of 90 days after transplantation reached 73.3%.

Key words： Milletia speciosa； in vitro culture； seed； stem with buds； callus； transplant

牛大力（Radix Millettia Speciosa），又名山蓮藕、金鐘根、倒吊金鐘等，為蝶形花科植物美麗崖豆藤（Milletia speciosa Champ.）的干燥根[1]，是著名的南藥之一，其味甘、性平，歸肺、腎經(jīng)[2]，在海南、兩廣地區(qū)廣泛用作煲湯原料、制作藥膳、藥酒等[3-7]，臨床研究證明其對(duì)腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、慢性支氣管炎等具有一定療效[8]。近年來(lái)由于市場(chǎng)需求劇增，牛大力野生資源經(jīng)過(guò)多年采挖，蘊(yùn)藏量逐漸減少，生產(chǎn)及制藥原料供應(yīng)日趨緊張，價(jià)格不斷攀升[9]。目前牛大力的人工栽培技術(shù)尚不成熟，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖也還停留在初步研究階段[10-12]。本實(shí)驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上，以牛大力種子、帶芽莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)，篩選出最佳的滅菌方法和各個(gè)生長(zhǎng)階段的最佳激素組合，建立牛大力的無(wú)性培養(yǎng)技術(shù)，為保護(hù)和開發(fā)牛大力資源、實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛大力種子于2011年5月采自廣西隆安，帶芽莖段于2011年5月采自從海南引種的移栽苗，取材時(shí)間為上午9∶30～10∶00。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 取牛大力成熟種子放入燒杯中，添加2滴洗潔精清洗表面污垢，流水沖洗8～10 min后移至超凈工作臺(tái)，體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇浸泡40 s，無(wú)菌水沖洗1次，再用1 g/L HgCl2消毒6～15 min，無(wú)菌水沖洗5次。

選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的植株，剪取幼嫩帶芽莖段作為外植體，剪除葉片后放入燒杯中，加適量自來(lái)水及2～3滴洗潔精，輕輕搖動(dòng)，用棉花輕輕擦洗表面泥土，然后在自來(lái)水下沖洗15 min，體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗1次，再用1 g/L HgCl2消毒10～20 min，無(wú)菌水沖洗5次。

用無(wú)菌濾紙吸干種子和莖段外植體表面水分后用消毒好的鑷子夾住，插入培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理接種8瓶。

1.2.2 不同激素組合對(duì)牛大力組織培養(yǎng)的影響 基本培養(yǎng)基為MS，含5 mg/L瓊脂、30 mg/L蔗糖，pH 5.8～6.0。將消毒好的牛大力種子、帶芽莖段接種到含0.5 mg/L NAA，6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L或0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA，IBA濃度分別為0.1、0.3、0.5 mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)；取種子、帶芽莖段誘導(dǎo)后所產(chǎn)生的不定芽接種到含0.5 mg/L NAA，6-BA濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/L的固體分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。將生長(zhǎng)健壯、高2～4 cm的不定芽或者芽叢接種到分別以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度NAA和IBA的壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度（25±2）℃、光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度20～30 μmol/（m2·s）。30 d后統(tǒng)計(jì)出芽率、污染率、分化率、生根率等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體的滅菌效果

先用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇浸泡種子和帶芽莖段，再用1 g/L HgCl2對(duì)2種牛大力外植體材料滅菌，不同處理時(shí)間下的滅菌效果見表1。從表1可以看出，用1 g/L HgCl2對(duì)牛大力種子進(jìn)行滅菌后種子均能出芽，而且出芽率較高。消毒時(shí)間為10 min時(shí)出芽率最高，為91.7%，而且其污染率也最低，為8.3%，所有種子均未產(chǎn)生愈傷組織和出現(xiàn)褐化。而莖段消毒后出芽率相對(duì)較低，1 g/L HgCl2消毒時(shí)間為15 min時(shí)其出芽率最高，為41.7%。此時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率也最高，為54.2%；而污染率較低，為4.2%，且褐化率為0。

2.2 不同激素組合對(duì)牛大力愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響

外植體在添加0.5 mg/L NAA和不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)率和出芽率結(jié)果見表2。在激素組合1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)5 d后開始出芽，芽嫩綠、粗大（圖1），而莖段出芽時(shí)間較晚，培養(yǎng)15 d后才開始冒出嫩綠的小芽，且芽相對(duì)細(xì)弱（圖2），大部分莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)10～20 d后逐漸形成愈傷組織（圖3）。從表2可看出，牛大力的種子和帶芽莖段在含不同濃度激素組合的培養(yǎng)基中的愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)率不同，與僅添加6-BA和NAA的處理相比，附加IBA后愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)率均得到明顯提高，1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA +0.3 mg/L IBA處理中兩種外植體的不定芽誘導(dǎo)率均為最高，分別為95.8%和45.8%，帶芽莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率也高于其他處理。

2.3 不同激素組合對(duì)牛大力不定芽分化的影響

在添加不同濃度激素的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不定芽的分化情況見表3和圖4、圖5。由表3可以看出，不添加激素的培養(yǎng)基中不定芽分化率均較低，且沒(méi)有芽叢生出。添加不同濃度的激素后，不定芽的分化率提高，添加2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中分化率最高，達(dá)58.3%，但芽叢分化率還是較低，僅為20.8%。

2.4 不同培養(yǎng)基及激素濃度對(duì)試管苗生根的影響

將生長(zhǎng)健壯、高2～4 cm的不定芽或者芽叢接種到壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后根開始發(fā)生，葉片也逐漸增多，培養(yǎng)30 d后觀察統(tǒng)計(jì)生根率和試管苗長(zhǎng)勢(shì)，結(jié)果見表4。從表4可以看出，1/2MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更利于牛大力的生根，生根率升高，試管苗的長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)。相比而言，添加適當(dāng)濃度的NAA和IBA組合比單獨(dú)使用NAA生根效果好，生根率較高。最佳壯苗生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率可達(dá)70.8%，植株較為健壯、根粗、根系發(fā)達(dá)。

2.5 牛大力試管苗的煉苗移栽

試管苗生根培養(yǎng)25～30 d后選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)污染的試管苗進(jìn)行煉苗。打開培養(yǎng)瓶的蓋子，并注入少量水淹沒(méi)培養(yǎng)基，于室內(nèi)自然光下煉苗7 d，用鑷子小心取出試管苗，洗凈試管苗根部培養(yǎng)基（圖6），移栽到不同的基質(zhì)中?；|(zhì)以疏松透氣、排水良好、不易發(fā)霉為宜。移栽30、60、90 d后分別統(tǒng)計(jì)各基質(zhì)中的成活率見表5。因試管苗一直處于保溫保濕、遮陰的環(huán)境下，各處理表現(xiàn)出的成活率均較高，30 d最高成活率能達(dá)到93.3%；而60 d和90 d時(shí)成活率有較大差別：以單一的泥炭、河沙、黃土為基質(zhì)的處理中移栽成活率逐漸下降，3種處理間的移栽成活率差異不大，黃土、泥炭和河沙按等體積混合作為基質(zhì)，90 d時(shí)成活率為73.3%，移栽效果相對(duì)較好，為最佳的移栽基質(zhì)組合。同時(shí)，移栽后每周需噴施1～2次10倍稀釋的MS大量元素營(yíng)養(yǎng)液，并及時(shí)遮陽(yáng)，根據(jù)需要適當(dāng)噴施1 g/L的葉面肥等其他肥料，視基質(zhì)的干濕度噴水。

3 小結(jié)與討論

本研究分別采用牛大力種子和帶芽莖段進(jìn)行不定芽及愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)種子和帶芽莖段都能誘導(dǎo)出芽。相對(duì)而言，種子誘導(dǎo)效果較好，不僅誘導(dǎo)率高，而且誘導(dǎo)出的不定芽和試管苗比較粗壯，但種子材料儲(chǔ)藏時(shí)間不能超過(guò)半年，陳年種子誘導(dǎo)容易污染，很難成功誘導(dǎo)出芽。

帶芽莖段也較易誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽，但一般產(chǎn)生愈傷組織的莖段很難能誘導(dǎo)出不定芽，在培養(yǎng)1個(gè)月后觀察，愈傷組織出芽率不超過(guò)10%。觀察還發(fā)現(xiàn)，莖段離體過(guò)程中污染率較高，在試管苗繼代培養(yǎng)時(shí)莖段接觸培養(yǎng)基部位容易產(chǎn)生細(xì)菌，這可能和牛大力本身的分泌物及表面被有絨毛等有關(guān)。此外，莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織和不定芽較易褐化，而實(shí)驗(yàn)中一旦出現(xiàn)褐化或污染就很難再改善苗的質(zhì)量。本研究采取了無(wú)菌苗重復(fù)消毒、添加適當(dāng)濃度頭孢唑林鈉、暗培養(yǎng)等不同方法[11]，在一定程度上降低了褐化和污染率，但并沒(méi)取得本質(zhì)性的改善，還有待進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于牛大力離體培養(yǎng)及移栽研究的報(bào)道不多[9-12]，本研究在之前報(bào)道的基礎(chǔ)上進(jìn)行了種子與帶芽莖段組織培養(yǎng)及植株再生實(shí)驗(yàn)，并篩選出適宜的激素濃度組合和移栽基質(zhì)，初步建立了牛大力的無(wú)性系，可為進(jìn)一步探討其離體快繁、提高繁殖系數(shù)提供參考。

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（責(zé)任編輯 向 闈）