摘要：對12個秈稻（Oryza sativa L. subsp. Indica）品種（恢復(fù)系）進行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)的研究，建立了恢復(fù)系R305高效懸浮培養(yǎng)體系。對R305的懸浮細胞系進行甲基磺酸乙酯（EMS）不同體積分數(shù)、不同時間的誘變處理，結(jié)果表明EMS處理秈稻細胞懸浮系的適宜條件是0.6%的EMS處理4 h。

關(guān)鍵詞：秈稻（Oryza sativa L. subsp. Indica）；細胞懸浮培養(yǎng)；甲基磺酸乙酯（EMS）

中圖分類號：S511.2+1；Q943.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5496-03

Establishment of EMS Mutagenesis System of Indica Rice Cell Suspension Culture

ZHA Zhong-ping，WAN Bing-liang

（Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement / Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： The mature embryo callus induction，subculture， suspension culture of 12 Oryza sativa L. subsp. Indica varieties（restorer lines） were studied and the efficient suspension culture system for R305 was established. The suspension cell line of R305 was treated by chemical mutagen ethyl methane sulfonate （EMS） with different EMS concentration and different EMS treatment time. The results showed that 0.6% EMS with 4 h treatment was the best mutagenic treatment condition for O. sativa L. subsp. Indica suspension cell line.

Key words： Oryza sativa L. subsp. Indica； cell suspension culture； ethyl methane sulfonate （EMS）

水稻（Oryza sativa L.）是中國最主要的糧食作物之一，中國60%以上的人口以稻米為主食。水稻育種的實踐表明，育種水平的突破很大程度上取決于特異種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用。甲基磺酸乙酯（EMS）化學(xué)誘變技術(shù)是進行水稻種質(zhì)創(chuàng)新的一種行之有效的方法，利用該方法已經(jīng)創(chuàng)建了許多水稻突變體。如陳忠明等[1]、顧佳清等[2]、楊健源等[3]利用EMS處理水稻種子分別建立了“9311”、中花11和三黃占2號的突變體庫，篩選出多種不同表現(xiàn)型的突變體材料。但EMS處理種子的方法存在嵌合體多、穩(wěn)定緩慢、誘變效率低等缺點。植物細胞懸浮培養(yǎng)（Cell suspension culture）是細胞的微生物化培養(yǎng)，細胞懸浮系由單細胞或者細胞團組成，具有形狀均一、分散性好、繁殖快、體積小、易于規(guī)?；僮鞯忍攸c，是篩選細胞突變體的良好材料。細胞懸浮培養(yǎng)結(jié)合EMS誘變可提高細胞突變頻率、減少嵌合體出現(xiàn)、易于篩選出目標(biāo)突變體。如陶興魁等[4]利用EMS處理半夏懸浮細胞篩選出耐高溫細胞系。自O(shè)zawa等[5]首次報道從水稻未成熟胚中誘導(dǎo)得到懸浮培養(yǎng)的胚狀體發(fā)生系統(tǒng)以來，研究者已經(jīng)建立了大量水稻品種的細胞懸浮系[6-8]，但通過利用EMS處理水稻懸浮細胞獲得突變體材料的研究還很少。本研究以12個秈稻（Oryza sativa L. subsp. Indica）品種（恢復(fù)系）為材料進行懸浮培養(yǎng)，并對懸浮細胞系進行EMS誘變處理，以期建立秈稻懸浮細胞的EMS誘變體系，為創(chuàng)建新的水稻突變體材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于本研究的12個秈稻品種（恢復(fù)系）分別為R476、R106、R022、R459、R305、WH26、R3301、R527、R188、華潤2號、R1056及R609，上述秈稻品種（恢復(fù)系）材料均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所分子育種課題組提供；組織培養(yǎng)試劑及EMS誘變劑均購自武漢楚誠正茂科技工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秈稻胚性愈傷組織的獲得 將飽滿的秈稻品種（恢復(fù)系）成熟種子去殼后放在100 mL三角瓶中進行常規(guī)消毒，接種于MS+脯氨酸0.5 g/L+谷氨酰胺0.5 g/L+水解酪蛋白0.6 g/L+2，4-D 2.5 mg/L+蔗糖30.0 g/L+Phytage 13.0 g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種6～8粒成熟種子，28 ℃暗培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 經(jīng)過30 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)，將成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，轉(zhuǎn)到AB+脯氨酸0.6 g/L+谷氨酰胺0.5 g/L+水解酪蛋白0.8 g/L+2，4-D 3.0 mg/L+麥芽糖 30.0 g/L+Phytage 13.0 g/L的繼代培養(yǎng)基上進行愈傷組織繼代培養(yǎng)，繼代時剔除褐色愈傷組織，每2周繼代1次。

1.2.3 懸浮細胞系的建立 從繼代培養(yǎng)的愈傷組織中挑選生長旺盛、色澤鮮黃、顆粒狀的愈傷組織接種于盛有180 mL的液體懸浮培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，搖床上振蕩培養(yǎng)。搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，28 ℃暗培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)液除不含植物凝膠外，其他成分與繼代培養(yǎng)基相同。懸浮培養(yǎng)初期用無菌的1 mL移液槍頭（略剪去尖頭部分）吸取培養(yǎng)液底部新鮮的愈傷組織到新的懸浮液中，每周繼代1次，如此繼代培養(yǎng)60 d，待愈傷組織狀態(tài)改善后繼代培養(yǎng)可以簡便操作，即每次繼代只需要去除原三角瓶2/3的培養(yǎng)液后再補充新鮮培養(yǎng)液。

1.2.4 EMS誘變處理條件的篩選 以懸浮培養(yǎng)液為溶劑，配制體積分數(shù)為0.2%、0.4%、0.6%的EMS溶液。用無菌藥勺取相同量的懸浮細胞系，用不同體積分數(shù)（0.0%、0.2%、0.4%、0.6%）的EMS（其中以不加EMS，即0.0%的培養(yǎng)液為對照）處理不同時間（2、4、6 h）。處理完畢后，用無菌水漂洗4～5次，再充分倒掉殘留的無菌水，換新鮮培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。觀察各處理的懸浮細胞系生長勢、生長量及生長狀態(tài)，篩選半致死處理體積分數(shù)及處理時間為最佳誘變條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 12個秈稻品種間愈傷組織誘導(dǎo)能力及繼代特性的差異

成熟胚接種30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1。不同品種（恢復(fù)系）間愈傷組織的誘導(dǎo)率沒有明顯差異，除R476愈傷組織誘導(dǎo)率為96%外，其余品種（恢復(fù)系）的誘導(dǎo)率均為100%。但不同品種（恢復(fù)系）間愈傷組織的生長狀態(tài)存在很大差異，由表1可見，其中R527、R188、R609 3個恢復(fù)系誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)最好，顏色鮮黃、質(zhì)地緊密，呈大小幾乎一致的顆粒狀胚性愈傷組織狀態(tài)；R476誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)最差，顏色偏白、質(zhì)地疏松，呈粉末水浸狀；其余品種（恢復(fù)系）的愈傷組織生長狀態(tài)一般，顏色淡黃，愈傷組織呈塊狀。各品種（恢復(fù)系）誘導(dǎo)的愈傷組織繼代特性差異明顯，如誘導(dǎo)能力較差的R476愈傷組織繼代1周后全部褐化；誘導(dǎo)能力中等的R106和R459愈傷組織繼代特性較差，愈傷組織繼代1周后開始褐化，繼代2代后全部褐化；誘導(dǎo)能力中等的R022、R305、WH26、R3301、華潤2號繼代后愈傷組織生長能力一般，愈傷組織狀態(tài)稍有改善，有的呈顆粒狀，有的呈塊狀；而誘導(dǎo)能力中等的R1056繼代特性好，愈傷組織繼代生長能力強，經(jīng)繼代2代后，顏色鮮黃，由初次誘導(dǎo)的塊狀愈傷組織生長成顆粒狀；誘導(dǎo)能力強的R527、R188、R609的愈傷組織繼代后仍然保持很好的繼代特性。

2.2 懸浮培養(yǎng)細胞系的建立及其形態(tài)特征

由于成熟胚直接誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)較差、數(shù)量有限，因此在懸浮培養(yǎng)之前，12個秈稻品種（恢復(fù)系）愈傷組織均經(jīng)2次固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，選取繼代培養(yǎng)后顏色鮮黃、質(zhì)地緊密、大小一致的顆粒狀愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)。除R476、R106、R459繼代全部褐化外，其余9個秈稻品種（恢復(fù)系）均進行了懸浮培養(yǎng)。在懸浮培養(yǎng)初期，每個品種（恢復(fù)系）都有不同程度的適應(yīng)現(xiàn)象，表現(xiàn)在愈傷組織褐化、細胞分泌物多、培養(yǎng)液由澄清透明變得渾濁黏稠。因此初期懸浮繼代時應(yīng)倒掉所有培養(yǎng)液，用1 mL槍頭吸取質(zhì)量相對稍好的愈傷組織，補充完全新鮮的培養(yǎng)液繼代。隨著繼代次數(shù)的增加，不同品種（恢復(fù)系）的懸浮培養(yǎng)特性差異較大，其中R527、華潤2號及R609 3個秈稻品種（恢復(fù)系）隨著懸浮培養(yǎng)次數(shù)的增加，褐化現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重直至死亡，培養(yǎng)液仍然澄清透明；而R022、R3301、R1056、R188及WH26懸浮培養(yǎng)中期褐化現(xiàn)象逐漸改善，但繁殖能力較弱，顆粒狀愈傷組織不能形成穩(wěn)定的細胞團，隨著培養(yǎng)次數(shù)的增加，到培養(yǎng)后期顆粒狀愈傷組織逐漸喪失增殖能力，培養(yǎng)液依然澄清透明。而R305經(jīng)過長時間的繼代，愈傷組織由開始懸浮培養(yǎng)時較大的顆粒狀逐漸繁殖成細小、均一、致密、穩(wěn)定生長的細胞團。細胞團形成后，繁殖能力強且穩(wěn)定，一般7 d后培養(yǎng)液變得渾濁但不黏稠，說明懸浮培養(yǎng)體系已穩(wěn)定建立且細胞繁殖旺盛。在懸浮培養(yǎng)過程中，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液顏色的轉(zhuǎn)變可以作為R305懸浮細胞系繁殖能力和繁殖周期的一個間接指標(biāo)。當(dāng)培養(yǎng)液開始變得渾濁時，說明細胞團已開始啟動分裂并開始增殖，這時在三角瓶的底部會看到少許細小的新鮮細胞團發(fā)生。當(dāng)細胞團的數(shù)量增加時培養(yǎng)液的渾濁度也增加。

2.3 EMS誘變體系的建立

對建立好的R305懸浮培養(yǎng)系進行EMS溶液不同體積分數(shù)、不同時間的誘變處理。發(fā)現(xiàn)相對不處理的細胞系而言，不同體積分數(shù)的EMS對懸浮細胞系的生長均有一定的抑制作用。表現(xiàn)在處理后懸浮培養(yǎng)系有一定的褐變、生長變得緩慢，培養(yǎng)液在繼代過程中相對澄清透明，且隨著EMS體積分數(shù)的增加和處理時間的延長，抑制作用也增強，懸浮細胞團褐化，死亡率增加。在處理體積分數(shù)為0.6%、處理時間為4 h時，觀察到三角瓶中細胞團有部分褐化和增殖現(xiàn)象，在接種量相同的情況下，該處理條件下細胞團的增殖量約為不用EMS處理生長量的50%。而在EMS處理體積分數(shù)為0.6%、處理時間為6 h時，所有的細胞團幾乎都褐化并停止生長，培養(yǎng)液澄清透明。其他處理條件下細胞團雖有褐化現(xiàn)象，但生長量與未用EMS處理的無明顯差異。

3 小結(jié)與討論

1）盡管水稻細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，并且多個水稻品種的懸浮體系已經(jīng)建立[6-8]，但基因型差異仍是水稻懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵制約因素。本研究對12個秈稻品種（恢復(fù)系）的懸浮培養(yǎng)技術(shù)體系進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同品種（恢復(fù)系）的成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)能力及懸浮培養(yǎng)能力差異很大，并且觀察到愈傷組織繼代特性和懸浮培養(yǎng)能力并不一致。R1056繼代特性最好，但其懸浮培養(yǎng)能力一般，相反繼代特性中等的R305的懸浮培養(yǎng)能力最強。這說明秈稻種子成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)能力、繼代能力和懸浮培養(yǎng)能力可能是由不同基因控制的。因此針對不同的秈稻品種，需要通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化建立適合的懸浮培養(yǎng)體系。本研究采取的培養(yǎng)體系適合于R305的懸浮培養(yǎng)，利用該體系培養(yǎng)的R305細胞懸浮系分散性好、生長快、胚性強，可為下一步深入研究提供試驗材料。

2）EMS誘變處理條件簡單，突變頻率高，能夠在短時間內(nèi)構(gòu)建出具有大量突變體的誘變?nèi)后w。有學(xué)者利用EMS誘變的方法曾創(chuàng)造出豐富的水稻變異材料[1-3]，一些突變體在農(nóng)作物誘變育種中發(fā)揮了極其重要的作用。但目前的研究多以成熟的水稻種子為誘變材料，對突變體材料的選擇也多以地上部分的農(nóng)藝性狀為主，容易出現(xiàn)嵌合體，突變效率低。本研究建立了R305懸浮培養(yǎng)的誘變體系，較種子或植株水平而言，懸浮細胞系由單細胞或小細胞團組成，與藥液接觸充分，EMS滲透能力強，因此理論上懸浮細胞的EMS誘變體系誘變效率高、嵌合體少、穩(wěn)定快，但同時在技術(shù)上對EMS體積分數(shù)及處理時間的控制更為嚴(yán)格。本研究篩選到EMS體積分數(shù)0.6%、處理時間4 h為最佳處理條件。但懸浮細胞系的EMS誘變效率是否高于種子誘變處理，還有待進一步研究。

3）利用懸浮細胞系，結(jié)合EMS誘變及生物或非生物逆境脅迫，有望選擇到特定的突變體材料。利用離體培養(yǎng)篩選突變體的研究有很多，如在培養(yǎng)基中加入濃度較高的鹽選擇耐鹽突變體[9，10]；在高溫或低溫條件下懸浮培養(yǎng)選擇耐高溫或耐低溫的突變體[11]；在低氮培養(yǎng)基中選擇氮高效利用突變體或使用病原菌的毒素或培養(yǎng)濾液選擇抗病突變體等[12，13]。較田間脅迫處理而言，懸浮細胞系生理狀態(tài)基本相同，生長條件容易控制，避免了環(huán)境因素的干擾，而且操作簡便易行。因此可以根據(jù)具體的育種目標(biāo)，在EMS處理后對懸浮細胞系進行特定的脅迫處理，有望高效而快速地篩選到理想的突變體材料。

參考文獻：

[1] 陳忠明，王秀娥，趙 彥，等.水稻93-11 EMS誘導(dǎo)突變體的分離與鑒定[J].分子植物育種，2004，2（3）：331-335.

[2] 顧佳清，張智奇，周 音，等.EMS誘導(dǎo)水稻中花11突變體的篩選和鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，21（1）：7-11.

[3] 楊健源，張少紅，姜先芽，等.三黃占2號EMS誘變突變體庫的構(gòu)建與稻瘟病抗性初步評價[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（16）：1-3.

[4] 陶興魁，張愛民，薛建平，等.半夏懸浮培養(yǎng)細胞的EMS誘變和耐高溫突變體篩選[J].中國藥學(xué)雜志，2012，47（12）：1731-1733.

[5] OZAWA K，KONAMINE A.Establishment of a system of high-frequency embryogenesis from long-term cell suspension cultures of rice[J]. Theor Appl Genet，1989，77（2）：205-211.

[6] 袁力勇，李紹清，李陽生，等.水稻懸浮細胞系的建立[J].云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，25（4）：373-376.

[7] 王忠安.水稻佳輻占成熟種胚培養(yǎng)及其懸浮細胞系的建立[J].廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，44（6）：180-181.

[8] 尹德東，胡寶忠.日本晴水稻懸浮細胞系的建立和保存[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（6）：750-754.

[9] 張綺紋，張望東.群眾楊39無性系耐鹽懸浮細胞系的建立和體細胞變異體完整植株的誘導(dǎo)[J].林業(yè)科學(xué)研究，1995，8（4）：395-401.

[10] 張建華，陳火英，莊天明.番茄耐鹽體細胞變異體的離體篩選[J].西北植物學(xué)報，2002，22（2）：257-262.

[11] 葉曉青，佘建明，梁流芳，等.海雀稗體細胞低溫篩選獲得耐寒突變體[J].草地學(xué)報，2010，18（1）：97-102.

[12] 何曉明，謝大森，彭慶務(wù)，等.節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體的篩選和特性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009（2）：172-175.

[13] 周 楠，崔葉龍.抗小麥赤霉病體細胞突變體篩選研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，1993，9（2）：22-27.

（責(zé)任編輯 昌炎新）