摘要：通過酸水解法處理茶葉樣品，以陽離子交換-茚三酮柱后衍生法分析水解液中的氨基酸含量，以歸一法計(jì)算各氨基酸的峰面積比例，繪制了茶葉水解氨基酸的指紋圖譜，并進(jìn)行了主成分分析。結(jié)果表明，茶葉中水解氨基酸總含量在18.00%～30.00%之間，水解氨基酸指紋圖譜能夠較好區(qū)分龍井群體和龍井43，同時(shí)也可區(qū)分龍井茶與其他茶葉，與主成分分析結(jié)果基本一致。該法的建立為研究茶葉品質(zhì)提供了新的思路，同時(shí)也為名優(yōu)茶葉的真?zhèn)舞b別和追蹤溯源提供參考。

關(guān)鍵詞：茶葉；氨基酸；指紋圖譜；主成分分析

中圖分類號：O657.7+5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5463-04

Preliminary Study on the Amino Acids’ Fingerprint of Tea

ZHOU You-xiang，ZHAO Ming-ming，DING Hua，YAN Wei，ZHANG Yi，WANG Jing，HU Xi-zhou，

GONG Yan，HU Ding-jin

（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064， China）

Abstract： The amino acids in tea were quantitatively analyzed by cation exchange chromatography-ninhydrin post column derivatization after hydrolyzed by hydrochloric acid， then the amino acids fingerprint of tea was studied according to the ratio of different amino acid areas obtained by normalization method， the principal component analysis was also carried out. The results showed that the content of total amino acids in tea was in the ranged of 18.00% to 30.00%. In the fingerprints of the hydrolyzed amino acids， the difference between the tea varieties of Longjing groups and Longjing 43 was easy to differentiate. The similar result of principal component analysis and fingerprint analysis was also observed between Longjing tea and other tea. In concluding， it was a new method to analyze the quality of tea which would provide a reference for the authenticity identification and authentic identity of the famous tea.

Key words： tea； amino acid； fingerprint； principal component analysis

茶葉是中國最主要的飲品，由于受到地域、氣候、加工工藝和儲藏條件的影響，產(chǎn)生了許多具有地理代表性的名優(yōu)茶葉，深受人們喜愛[1]。但由于名優(yōu)茶葉受到生產(chǎn)規(guī)模和工藝的限制，導(dǎo)致目前茶葉市場種類良莠不齊，不同茶葉等級、新陳茶假冒和摻偽現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重干擾了正常的市場秩序，損害了名優(yōu)茶葉的聲譽(yù)。因此研究鑒別名優(yōu)茶葉品質(zhì)的技術(shù)手段十分必要[2，3]。

目前茶葉分類鑒定方法主要包括3類：感官評價(jià)、化學(xué)指紋和生物指紋分析。其中感官評價(jià)一直是評價(jià)茶葉品質(zhì)的主要方法，但這類方法的主觀性較強(qiáng)，易受評審人員的主觀因素影響；化學(xué)指紋包括色譜指紋、光譜指紋和波譜指紋等，對中草藥的質(zhì)量控制已取得了顯著效果[3，4]，其中色譜指紋通常以色譜峰的保留時(shí)間和定性參考物為指標(biāo)，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析方法，具有較顯著的特征性[5]；生物指紋主要包括基于蛋白水平的蛋白指紋和基于基因水平的分子指紋，常用于茶葉品種的鑒定和分析。茶葉中的氨基酸既是茶葉獨(dú)特風(fēng)味的重要組成部分，也是蛋白質(zhì)的構(gòu)成單元，研究茶葉中氨基酸指紋圖譜將有助于建立茶葉化學(xué)指紋和生物指紋間的相互關(guān)系[6]，為計(jì)算機(jī)解析與綜合評價(jià)圖譜、制定標(biāo)準(zhǔn)茶葉色譜指紋圖譜提供理論參考和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年在浙江杭州采集龍井43和龍井群體各1份；在湖北采集綠茶18份，粉碎后過20目篩，密封保存，待測。

1.2 儀器

全自動氨基酸分析儀（日立，L-8800）。

1.3 方法

1.3.1 茶葉中氨基酸的檢測 稱取0.100 0 g粉碎茶葉樣品于玻璃水解管中，加入12 mL 6.00 mol/L鹽酸溶液，在真空狀態(tài)下將水解管封口，于110 ℃水解22 h，冷卻后定容至100 mL，雙層濾紙過濾。取1 mL濾液于65 ℃水浴蒸干，殘留物用2 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液定容，過0.22 μm微孔濾膜，待測。采用離子交換色譜-茚三酮柱后衍生法進(jìn)行分析[7]。

1.3.2 茶葉中氨基酸指紋圖譜的繪制 將茶葉中各氨基酸的峰面積進(jìn)行歸一化處理，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制茶葉水解氨基酸的指紋圖譜[8]。

1.3.3 主成分分析 將茶葉氨基酸的峰面積進(jìn)行歸一化處理，并輸入SIMCA-P軟件，進(jìn)行主成分分析[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉中的水解氨基酸含量

采用酸水解法測定的部分茶葉樣品見圖1。由圖1可知，茶葉樣品的酸水解液中共檢出17種氨基酸，總氨基酸的質(zhì)量百分含量在18.00%～30.00%之間，其中氨基酸均值含量在1.50%以上的包括：谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）和天門冬氨酸（Asp）等，其中Arg和Glu的標(biāo)準(zhǔn)偏差大于1，表明這2種氨基酸含量變化較大，這可能是與茶葉品種和樣品水分含量有關(guān)。另外，由氨基酸色譜圖可知，各樣品中均有17種氨基酸檢出，且各氨基酸的保留時(shí)間無差異，因此，僅從色譜圖難以有效鑒別茶葉樣品的差異。

2.2 歸一法繪制茶葉樣品的指紋圖譜

以各樣品的氨基酸峰面積為分量，計(jì)算氨基酸峰面積總和，求得茶葉樣品中各氨基酸分量所占的比例。通過SPSS軟件繪制酸水解的茶葉氨基酸指紋圖譜，由圖2可知，Glu在茶葉中所含比例最大，其次是Gly、Asp、Leu和Lys等，通過氨基酸的相對含量大小及相對位置可以對茶葉樣品進(jìn)行分類和品種分析。例如：龍井43和龍井群體同屬于龍井茶，其氨基酸排列順序是一致的，僅是峰面積大小不同，較之其他綠茶，其氨基酸的排列順序有明顯差異：①氨基酸分量水平在5%以下時(shí)，僅有烘青茶、伍臺翠露以及綠茶2樣品的Asp和Gly含量與龍井茶相似；②氨基酸分量水平在10%水平附近時(shí)，這3個(gè)樣品的Asp、Gly、Lys以及Leu位置指紋不一致，因此得以區(qū)分；③信陽毛尖4個(gè)樣品的指紋圖譜基本相似，Cys和Met位置均高于Pro，且與其他樣品的指紋圖譜不一致。

為了能夠最大限度地放大各氨基酸分量間的相對含量差異，分別選取了含量最大的Glu和標(biāo)準(zhǔn)偏差最小的Pro為參照氨基酸，繪制氨基酸指紋圖譜，結(jié)果見圖3和圖4。當(dāng)選取含量最大的Glu為參照氨基酸時(shí)，各氨基酸組分的差異可進(jìn)一步放大。例如：龍井43和龍井群體2種茶葉樣品中各氨基酸間的差異更加明顯，與龍井茶指紋特征相似的烘青茶、伍臺翠露以及綠茶2的Asp和Gly指紋幾乎重疊，而龍井43和龍井群體間隔明顯大于上述3種茶葉，故可用于區(qū)分龍井與其他綠茶。當(dāng)選取Pro為參照氨基酸時(shí)，由于各茶葉樣品的Pro含量相對穩(wěn)定，其指紋特征與圖2相似，特征性指標(biāo)的分辨能力有限，僅適用于樣品的歸類分析。例如：4份信陽毛尖樣品在圖4中具有較高的相似度，可初步判斷這幾個(gè)樣品的來源相似；而鄧村綠茶與綠茶3、綠茶4指紋圖譜相似度較高，也可初步判斷這3個(gè)樣品具有相似來源。

2.3 主成分分析

主成分分析法能夠簡單、直觀地表征樣本數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)特征，并可以對高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，以達(dá)到減少數(shù)據(jù)計(jì)算量的目的。20份茶葉樣品的氨基酸峰面積的主成分分析結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，20份茶葉樣品在第一維主成分（t[1]）中可分為兩類，其中以龍井群體和龍井43為代表的7份樣品為一類，而以信陽毛尖、鄧村綠茶、烘青茶等為代表的13份樣品為另一類，該結(jié)果與上述指紋圖譜的區(qū)分結(jié)果基本一致；在第二維主成分（t[2]）中各樣品進(jìn)一步分散為4個(gè)區(qū)間，表明這些茶葉樣品還可以根據(jù)第二維主成分進(jìn)一步細(xì)分，但該分析需要建立在大量樣品基礎(chǔ)上才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 小結(jié)與討論

3.1 水解氨基酸的有效性

上述結(jié)果是基于茶葉樣品酸水解的氨基酸指紋分析，但由于酸水解對于某些氨基酸（如Try、Met以及Cys等）破壞較嚴(yán)重，特別是茶葉中的特征氨基酸—茶氨酸經(jīng)酸水解后，幾乎全部降解，使得酸水解法獲得的氨基酸難以全面體現(xiàn)茶葉中的指紋特征。但另一方面，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶葉樣品游離氨基酸中的茶氨酸占總氨基酸含量的50%左右，且色譜圖的保留時(shí)間還在Thr和Ser之間，嚴(yán)重干擾3種氨基酸的積分，而其他氨基酸峰面積含量較小，這導(dǎo)致在分析過程中會產(chǎn)生較大的隨機(jī)誤差，甚至是系統(tǒng)誤差。因此，在比較水解和游離兩類氨基酸分析方法的基礎(chǔ)上，選擇了茶葉水解氨基酸作為分析材料。

3.2 氨基酸指紋圖譜的特異性

氨基酸指紋圖譜屬于HPLC指紋圖譜范疇，傳統(tǒng)的HPLC指紋通常是根據(jù)目標(biāo)物的標(biāo)志物和保留時(shí)間進(jìn)行分析。本研究在氨基酸柱后衍生法的基礎(chǔ)上借鑒了分子指紋的表述方式，成功實(shí)現(xiàn)了電泳圖式的氨基酸指紋圖譜，但需要指出的是，生物指紋（如RAPD、ISSR或者同工酶等）通常是以“有”或“無”來表述，具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[10]，而上述氨基酸指紋主要是依據(jù)各氨基酸的相對位置和含量順序進(jìn)行區(qū)分，受到前處理?xiàng)l件、色譜條件等因素影響，該指紋的特異性弱于生物指紋。因此后續(xù)研究將在該氨基酸指紋分析的基礎(chǔ)上，通過引入模糊信息分析法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法、灰色關(guān)聯(lián)聚類法以及非線性映照法等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，提高本方法的適用性和特異性，實(shí)現(xiàn)對茶葉樣品的有效區(qū)分。

3.3 氨基酸指紋圖譜的代表性

建立茶葉指紋圖譜的根本目的是為了有效鑒定茶葉品質(zhì)。根據(jù)本研究的分析結(jié)果，雖然可以初步區(qū)分龍井和其他綠茶，也可以分辨龍井群體和龍井43的差異，但是由于樣品有限，尚難以有效證明該方法的代表性，后續(xù)研究將圍繞同一品種的不同產(chǎn)地、不同采摘時(shí)間和摻偽茶葉開展氨基酸指紋研究，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，開發(fā)多維多特征的茶葉指紋圖譜。

綜上所述，本研究在分析了茶葉樣品中的水解氨基酸含量的基礎(chǔ)上，首次借鑒分子生物學(xué)的DNA指紋圖譜表述方式，建立了基于電泳圖式的茶葉HPLC指紋圖譜，通過該方法分析了20份茶葉樣品的氨基酸指紋圖譜，為后期建立我國名優(yōu)茶葉的氨基酸指紋圖譜奠定了部分技術(shù)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 胡西洲）