摘要：采用Alcalase堿性蛋白酶水解花生粕，設(shè)計單因素試驗和正交試驗考察水解時間、花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量、溫度、pH等因素對水解度的影響，優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，最佳的水解條件為酶解溫度60 ℃、pH 8.5，反應(yīng)體系中花生粕和酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和7%，酶解時間4 h。在此條件下花生粕蛋白的水解度可達29.18%。

關(guān)鍵詞：花生粕；水解；堿性蛋白酶

中圖分類號：TS229 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5460-03

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Peanut Meal

SUN Su-ling，WU Hao，LI Xian，ZHANG Gan-wei

（College of Life Chemical Engineering， Huanggang Normal College， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： Peanut meal was hydrolyzed with alcalase alkaline protease. Effects of reaction time， mass ratio of peanut meal， dose of enzyme， reaction temperature and pH on hydrolysis degree of peanut meal protein were studied by single factor tests and orthogonal experiment. The results showed that the optimum hydrolysis conditions were as follows， reaction temperature， 60 ℃； pH 8.5； mass ratio of peanut meal， 5%； enzyme dose， 7%； and reaction time， 4 h. Under these conditions， the hydrolysis degree of peanut meal protein was 29.18%.

Key words： peanut meal； hydrolysis； alkaline protease

花生是中國主要的油料作物之一，經(jīng)傳統(tǒng)方式壓榨或浸出制油后的花生粕主要用于動物飼料和肥料[2]。近年來研究表明，花生粕中蛋白質(zhì)含量在40%以上[1]，其氨基酸分布廣泛，構(gòu)成比例接近于動物蛋白[3]，且其含有的小分子多肽可以由腸道直接吸收[4]，更易被人體利用。本研究以花生粕為原料，采用堿性蛋白酶對其進行水解，制備花生粕蛋白水解產(chǎn)品?？疾炝嗣附鉁囟取r間、pH、酶用量、花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解效果的影響，并優(yōu)化酶解工藝條件，以期為花生粕蛋白資源的開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 花生粕，廣州竹香緣有限公司出品；福林酚試劑，Sigma公司；堿性蛋白酶，丹麥諾維信（中國）投資有限公司，酶活力為4 534 U/g；酪蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 試驗儀器 SHA-B型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；DELTA320型pH計，梅特勒-托利多（上海）有限公司；TDL-40B型臺式離心機，廣州晟龍試驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解試驗過程 取250 mL錐形瓶5個，加入一定量制備好的花生粕漿液，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH為9.0，用蒸餾水定量到100 g，用膠頭滴管滴加一定量的堿性蛋白酶，用保鮮膜將錐形瓶封口，置于已經(jīng)調(diào)好溫度和加水量的恒溫振蕩器，每隔0.5 h測定1次pH并用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)到所選定的pH，放回振蕩器中繼續(xù)酶解，記錄NaOH的消耗量。

1.2.2 單因素試驗 設(shè)置單因素試驗分別考察酶用量、pH、酶解溫度、酶解時間和花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解反應(yīng)蛋白質(zhì)水解度的影響。①酶用量?；ㄉ少|(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，酶用量分別為3%、4%、5%、6%、7%（占反應(yīng)體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），pH 9.0，在55 ℃酶解4 h。②pH。酶用量為6%，花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，調(diào)節(jié)酶解體系pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，在55 ℃酶解4 h。③酶解溫度。花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，酶用量為5%，pH 9.0，分別在45、50、55、60、65 ℃酶解4 h，。④酶解時間。花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，酶用量為5%，pH 9.0，在55 ℃分別酶解1、2、3、4、5 h。⑤花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)?；ㄉ少|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%，酶用量為5%，pH 9.0，在55 ℃酶解4 h。

1.2.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用五因素四水平正交設(shè)計進一步考察酶解溫度、酶解時間、酶用量、花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH對蛋白質(zhì)水解度的影響，因素與水平見表1。

1.2.4 指標(biāo)測定 堿性蛋白酶酶活力測定及計算方法見參考文獻[5]；水解度的測定見參考文獻[6]、[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶用量對酶解反應(yīng)的影響 酶用量對花生粕蛋白水解度的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，在試驗范圍內(nèi)蛋白質(zhì)水解度隨酶用量的增加而升高，酶用量為3%～6%時水解度上升速度較快，之后上升趨勢變得平緩，酶用量為6%或7%時，蛋白質(zhì)的水解度相差不大。原因可能是隨著酶用量的增加，酶對底物達到飽和，再增加酶用量，水解度增加不大，且過多的蛋白酶分子可能會抑制中間產(chǎn)物向酶水解反應(yīng)終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化[8]。綜合考慮經(jīng)濟性和效率，較佳的酶用量為6%。

2.1.2 pH對酶解反應(yīng)的影響 pH對花生粕蛋白水解度的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，花生粕蛋白水解度隨著pH的增加先增大后減小，pH為9.0時水解度達到最大?？梢娫囼炈妹傅淖钸mpH為9.0。

2.1.3 酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響 酶解溫度對花生粕蛋白水解度的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，水解度隨著酶解溫度的升高先上升后降低，溫度為60 ℃時水解度最高，可見所用酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.1.4 酶解時間對酶解反應(yīng)的影響 酶解時間對花生粕蛋白水解度的影響結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，酶解體系中花生粕蛋白逐漸被水解為氨基酸，水解度不斷升高，同時底物濃度不斷降低，4 h時大部分的花生粕蛋白已被水解，再延長水解時間，水解度升高幅度不大。

2.1.5 花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解反應(yīng)的影響 花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)對花生粕蛋白水解度的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～5%時，水解度變化不大；而花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過5%時，水解度迅速降低?？梢娫诿赣昧恳欢ǖ那闆r下，底物濃度不能過高，否則會造成水解度的降低。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。由極差分析可知，各因素對花生粕蛋白水解度的影響由大到小依次為花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量、酶解溫度、pH、酶解時間。最佳的工藝組合為A3B1C4D1E2，即花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、酶用量7%、酶解溫度60 ℃、pH 8.5、酶解時間4 h。由“2.1.5”可知，當(dāng)花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%和5%時，水解度相差不大，同時考慮到工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟效應(yīng)，選擇花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。在花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量7%、酶解溫度60 ℃、pH 8.5、酶解時間4 h的條件下進行驗證試驗，所得花生粕蛋白的水解度為29.18%，高于所有正交試驗組合的結(jié)果。

3 小結(jié)與討論

采用Alcalase堿性蛋白酶對花生粕進行水解，優(yōu)化的酶解條件為花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量7%、酶解溫度60 ℃、pH 8.5、酶解時間4 h，此條件下花生粕蛋白的水解度可達29.18%。本研究將為花生粕的開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)，并將增加花生粕的附加利用值。

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（責(zé)任編輯 向 闈）