摘要：采用體積分數(shù)95%的乙醇浸提與超聲波相結(jié)合的方法提取竹葉黃酮，并通過鄰苯三酚自氧化法和Fenton反應(yīng)測定其抗氧化性能。結(jié)果表明，竹葉黃酮的提取率為5.30%，粗提物中黃酮的含量為13.90%。0.2 mL 1 mg/mL竹葉黃酮對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率為17.39%；0.7 mL 1 mg/mL竹葉黃酮對羥 基自由基（·OH）的清除率為58.20%，表明竹葉黃酮有優(yōu)良的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：竹葉；總黃酮；提??；抗氧化

中圖分類號：R284.2；R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5457-03

Extraction of Flavonoids from Bamboo Leaves and Their Antioxidant Activity

JIANG Hui-hua1，LIU Jun-shao1，CHEN Pei-zhen1，MA Sen1，CHEN Liang-bing1，LIU Rui-lai1，2

（1. The Key Laboratory for Green Chemical Engineering Technology of Fujian Higher Education/Department of Environmental and Architectural Engineering， Wuyi University， Wuyishan 354300， Fujian， China； 2. College of Chemistry and Materials Science， Fujian Normal University， Fuzhou 350007， China）

Abstract： Total flavonoids were extracted from bamboo leaves by 95% ethanol as solvent and ultrasonic. The oxidation activity of flavonoids in bamboo leaf was determined by the methods of pyrogallol autoxidation and Fenton reaction. The results showed that the extraction yield of flavonoids from bamboo leaf was 5.30%， and the content of flavonoids in the crude extract was 13.90%. The clearance rate of O2-· by 0.2 mL 1 mg/mL bamboo leaf flavonoids was 17.39%； while the clearance rate of ·OH by 0.7 mL 1 mg/mL bamboo beaf flavonoids was 58.20%， it showed that flavonoids in bamboo leaf had good antioxidant activity.

Key words： bamboo leaf； total flavonoids； extraction； antioxidant activity

竹葉在中國有著悠久的食用和藥用歷史，其性淡、寒、味甘、微澀，具有清熱利尿、明目解毒、止血、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗艾滋病和抑制腫瘤等功效，且無毒無害，可作為綠色食品進行開發(fā)。竹葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，總黃酮含量平均在10 mg/g左右。竹葉黃酮具有優(yōu)良的抗?jié)?、解痙、抗菌、消炎、降血脂、鎮(zhèn)痛、利尿、降血清膽固醇和雌性激素、抗氧化等功效[1-7]。鄭德勇等[8]報道從竹葉中提取的總黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）具有顯著的清除能力；張英等[9]和章榮華等[10]研究發(fā)現(xiàn)竹葉黃酮能顯著提高衰老小鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px的活力，說明竹葉黃酮有優(yōu)良和穩(wěn)定的抗氧化活性。閩北是中國竹子之鄉(xiāng)，但目前對竹葉的利用十分有限，大部分被廢棄，未能得到充分的利用。本研究采用乙醇浸提和超聲波提取相結(jié)合的方法從竹葉中提取總黃酮，并采用鄰苯三酚自氧化法測定其清除超氧陰離子自由基（O2-·）的作用，用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基（·OH）使溴甲酚紫退色的方法測定竹葉黃酮清除羥基自由基的作用，為竹葉黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用竹葉采自福建省武夷山市，用蒸餾水洗凈后80 ℃烘干，粉碎、過40目篩，烘干備用。

主要試劑包括蘆丁標準品，購自國藥集團；維生素C，生物級，購于Fluka公司；溴甲酚紫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、Tris-HCl、EDTA、鄰苯三酚、乙醇、FeSO4·7H2O、過氧化氫、NaF、硫脲等均為市售分析純。主要儀器有721分光光度計（上海天普分析儀器有限公司）、超聲洗滌儀（深圳艾斯達超聲波設(shè)備有限公司）、索氏脂肪提取器（上海創(chuàng)萌生物技術(shù)有限公司）等。

1.2 竹葉黃酮的提取

稱取50.0 g竹葉粉末，置于索氏脂肪提取器中，用石油醚去除脂肪、色素至無色為止。竹葉粉末揮發(fā)除去石油醚后加入體積分數(shù)95%的乙醇450 mL，室溫浸提4 h，期間振搖數(shù)次，再在60 ℃、超聲波功率75 W的條件下提取5 min，過濾。殘渣同法再提取1次，合并兩次提取液，水浴減壓回收乙醇，濃縮至20 mL左右時移入提前稱好重量的培養(yǎng)皿，80 ℃下烘干乙醇得黃酮粗品，稱重，計算提取率。

1.3 竹葉黃酮含量測定

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制[11] 分別取0.2 mg/mL蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于8只25 mL容量瓶中，加入50 g/L的NaNO2 1.0 mL，搖勻，放置6 min后加入100 g/L的Al（NO3）3 1.0 mL，6 min后再加入40 g/L的NaOH溶液10.0 mL，混勻，用水稀釋至刻度，15 min后以第一管為空白參比，采用比色法在510 nm波長下測吸光度。以吸光度A510 nm為縱坐標、蘆丁濃度C為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 竹葉黃酮含量測定 準確稱取黃酮粗品100.0 mg，加入體積分數(shù)80%的乙醇溶液，搖勻，定容至100 mL，得到樣品液。精確吸取1.0 mL樣品液于25 mL容量瓶中，加入50 g/L的NaNO2 1.0 mL，搖勻，放置6 min后加入100 g/L的Al（NO3）3 1.0 mL，6 min后再加入40 g/L的NaOH溶液10.0 mL，混勻，用水稀釋至刻度，搖勻放置15 min后以試劑空白作參比測定A510 nm。由回歸方程求出稀溶液中總黃酮的濃度，計算提取物中黃酮的含量。

1.4 竹葉黃酮抗氧化活性的測定

1.4.1 竹葉黃酮對O2-·的清除作用[12] ①鄰苯三酚自氧化速率的測定。在2支試管中各加9 mL Tris-HCl-EDTA緩沖液，對照管加40 μL蒸餾水，混勻，以1 cm比色皿、420 nm調(diào)吸光度為零，測定管加40 μL鄰苯三酚，混勻后立即加入1 cm比色皿，每分鐘讀取420 nm處的吸光度A0，重復3次，以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制鄰苯三酚自氧化曲線。②竹葉黃酮對O2-·清除率的測定。在上述體系中分別加入0.1、0.2、0.3 mL 1 mg/mL竹葉黃酮，測定10 min時420 nm處的吸光度As。

O2-·的清除率I=■×100%

1.4.2 竹葉黃酮對·OH的清除作用[13] ①溴甲酚紫-鹽酸-Fe2+溶液空白實驗。于10 mL比色管中分別加入0.4 mL溴甲酚紫溶液、0.5 mL 0.1 mol/L鹽酸、1.0 mL 1 mmol/L硫酸鐵溶液、0.5 mL 0.1 mol/L過氧化氫溶液，用水稀釋到刻度，搖勻。置于30 ℃恒溫水浴中反應(yīng)8 min，取出后迅速加入0.2 mL 0.05 mol/L NaF溶液混勻終止反應(yīng)。用1 cm比色皿、以水為參比，測定溶液在420 nm處的吸光度A，同法測定溴甲酚紫-鹽酸溶液空白試液的吸光度A0，計算吸光度變化值△A=A0-A。②硫脲和竹葉黃酮對

·OH清除率的測定。在上述體系中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 1 mg/mL硫脲和竹葉黃酮，測定體系在420 nm處的吸光度As。

·OH的清除率D=■×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線與回歸方程

蘆丁濃度與吸光度A510 nm的關(guān)系曲線見圖1，對實驗數(shù)據(jù)進行二階線性回歸，得蘆丁濃度C對A510 nm的回歸方程A510 nm=0.407 9C+0.013 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。說明在8～48 mg/L范圍內(nèi)蘆丁濃度與吸光度A510 nm具有良好的線性關(guān)系。

2.2 竹葉黃酮的提取率和含量

以體積分數(shù)95%的乙醇溶液浸提結(jié)合超聲波法提取竹葉黃酮，從50.0 g竹葉粉末中提取得到的竹葉總黃酮粗品質(zhì)量為2.650 5 g，提取率為5.30%；根據(jù)測定的總黃酮濃度及蘆丁標準曲線回歸方程計算得到提取物中竹葉黃酮的含量為13.90%。

2.3 竹葉黃酮抗氧化性能的測定

2.3.1 竹葉黃酮對O2-·的清除作用 鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，并同時釋放出O2-·，O2-·又加速鄰苯三酚自氧化速率，同時產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物在420 nm處有強烈的吸收，通過測定吸光度A420 nm可以測定鄰苯三酚的自氧化速率。在該反應(yīng)體系中加入氧自由基清除劑時鄰苯三酚自氧化受阻，故可通過抑制鄰苯三酚自氧化的方法測定抗氧化劑體外清除O2-·的性能。在一定時間內(nèi)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物的積累與時間呈良好的線性關(guān)系[14-16]。本實驗中鄰苯三酚自氧化在10 min內(nèi)A420 nm和時間之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2），回歸方程為Y=0.017 0X-0.006 5，r=0.998 8，

10 min后A420 nm的增加顯著減慢，逐漸失去線性關(guān)系。因此本實驗通過測定反應(yīng)10 min時A420 nm的變化來測定竹葉黃酮對O2-·的清除率，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，竹葉黃酮的劑量由0.1 mL增加到0.2 mL時，O2-·的清除率由10.35%升高到17.39%，而后繼續(xù)增加劑量，清除率并沒有發(fā)生太大的變化。

2.3.2 竹葉黃酮對·OH的清除作用 通過抑制Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH使溴甲酚紫退色法測定硫脲和竹葉黃酮清除·OH的作用，圖4為不同劑量硫脲和竹葉黃酮對·OH的清除率。由圖4可知，0.1 mg/mL硫脲的劑量從0.1 mL增加到0.6 mL，其對

·OH的清除率升高；劑量為0.6 mL時清除率最高，為70.90%；繼續(xù)加大劑量清除率不再升高，這與張德莉等[17]的結(jié)果一致。1 mg/mL的竹葉黃酮用量從0.1 mL增加到0.7 mL時，其對·OH清除率從10.41%升高到58.20%，而后進一步增大竹葉黃酮的含量，清除率反而略有降低。

3 小結(jié)與討論

本研究采用乙醇浸提和超聲波相結(jié)合的方法提取竹葉黃酮，得到竹葉黃酮的提取率為5.30%，粗提物中黃酮的含量為13.90%。通過其抑制鄰苯三酚自氧化和Fenton反應(yīng)測定竹葉黃酮的抗氧化活性，結(jié)果顯示竹葉黃酮具有良好的抗氧化性能。本實驗可為竹葉中黃酮的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

參考文獻：

[1] SUN J， YUE Y D， TANG F， et al. Simultaneous HPTLC analysis of flavonoids in the leaves of three different species of bamboo[J]. JPC-Journal of Planar Chromatography-Modern TLC，2010，23（1）：40-45.

[2] 李 蕓，楊秀松，何計國.金花葵黃酮對高脂血癥大鼠血脂的影響[J].食品科學，2012，33（1）：248-251.

[3] 黃金龍，殷之武，何新華，等.銀杏葉總黃酮純化工藝研究[J].中草藥，2012，10（5）：13-16.

[4] 張甘良，汪 釗，朱國孟. 柑桔生物類黃酮柚皮苷生物活性的研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（9）：117-120.

[5] ZIELI■SKA D， ZIELI■SKI H. Antioxidant activity of flavone C-glucosides determined by updated analytical strategies[J]. Food Chemistry， 2011，124（2）：672-678.

[6] 王 芳，喬 璐，淡小艷，等.桑葉黃酮的提取及抗氧化研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2011，38（15）：76-79.

[7] ZHANG Y，TIE X W，BAO B L，et al. Metabolism of flavone C-glucosides and p-coumaric acid from antioxidant of bamboo leaves（AOB） in rats[J]. British Journal of Nutrition，2007，97（3）：484-494..

[8] 鄭德勇，安鑫南.叢生竹葉提取物的成分與清除自由基的能力[J].福建林學院學報，2004，24（3）：193-196.

[9] 張 英，唐莉莉，丁霄霖.竹葉功能因子生物抗氧化性質(zhì)的研究[J].營養(yǎng)學報，1998，20（3）：367-371.

[10] 章榮華，傅劍云，徐彩菊，等.竹葉提取物抗氧化作用研究[J].中藥藥理與臨床，2004，20（2）：22-23.

[11] 徐雅琴，李淑芹，付 紅.黃樹莓葉片中黃酮類物質(zhì)的提取及抗氧化性[J].化學研究與應(yīng)用，2002，14（6）：739-741.

[12] 王巨存，邢國勝，胡文鐸.有機鍺Ge-132對氧自由基和由羥自由基誘導的脂質(zhì)過氧化的影響[J].中國藥學雜志，1994，29（1）：23-25.

[13] 丁宗慶，李小玲.溴甲酚紫光度法測定水果的抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：54-57.

[14] 許申鴻，杭 瑚. 超氧化物歧化酶鄰苯三酚測活法的研究及改進[J].化學通報，2001，64（8）：516-519.

[15] 靜天玉，趙曉瑜.用終止劑改進超氧化物歧化酶鄰苯三酚測活法[J].生物化學與生物物理進展，1995，22（1）：84-86.

[16] 郭雪峰，岳永德，湯 鋒，等.用清除超氧陰離子自由基法評價竹葉提取物抗氧化能力[J]. 光譜學與光譜分析，2008，28（8）：1824-1826.

[17] 張德莉，羅光富，陳 燕，等.溴甲酚綠測定Fenton產(chǎn)生的羥基自由基[J].三峽大學學報，2005，27（5）：449-452.

（責任編輯 向 闈）