摘要：以油楊樹產(chǎn)脂內(nèi)生真菌為試驗菌株，考察了不同發(fā)酵條件如碳源、氮源、無機鹽質(zhì)量分數(shù)和pH對菌體生長和油脂積累的影響。結(jié)果表明，優(yōu)化的培養(yǎng)基中各營養(yǎng)元素的質(zhì)量分數(shù)分別為葡萄糖8%、酵母膏0.6%、硫酸鎂0.7%、硝酸鉀0.5%、磷酸二氫銨0.4%、硫酸銨0.4%，pH為5.3。此條件下真菌發(fā)酵產(chǎn)油脂的得率為49.88%。

關(guān)鍵詞：油楊樹內(nèi)生真菌；油脂；發(fā)酵

中圖分類號：Q939.97；TQ929 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5439-03

Optimization of Fermentation Conditions for Oil Production by Poplar Entophyte Fungus

ZHANG Xue-song1，ZHU Yuan2，GAO Da-xiang1，ZHAO Gui-hua1

（1.Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， Jiangsu， China；

2.Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing 210017， China）

Abstract： The effects of different fermentation conditions such as content of carbon source， nitrogen source and inorganic salts and pH on fungus growth and oil accumulation of oil poplar entophyte fungus were studied. The results showed that optimal mass ratio of nutrition elements in medium was glucose 8%， yeast extract 0.6%， MgSO4 0.7%，KNO3 0.5%，NH4H2PO4 0.4%，（NH4）2SO4 0.4%， and the optimum pH was 5.3. The yield of oil in fungus under such conditions was 49.88%.

Key words： oil poplar endophytic fungus； microbial grease； fermentation

油脂不僅是食品中不可缺少的重要成分之一，而且在工業(yè)上有重要用途。傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)主要來源于動植物的油脂。在當(dāng)今工業(yè)生產(chǎn)高速發(fā)展以及世界人口不斷增加的情況下，油脂呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的趨勢。針對這一情況，科學(xué)家們正在借助生物技術(shù)手段，利用微生物發(fā)酵把使用價值較低的農(nóng)副產(chǎn)品和食品工業(yè)的廢棄物轉(zhuǎn)化為油脂[1]。目前，國內(nèi)外已有各種酵母菌發(fā)酵產(chǎn)油脂的成熟技術(shù)，但對內(nèi)生真菌的產(chǎn)脂研究甚少，特別是對油楊樹內(nèi)生真菌產(chǎn)脂的研究尚未見報道。

本研究以油楊樹產(chǎn)脂內(nèi)生真菌為供試菌株，以優(yōu)化后的PDA培養(yǎng)基為產(chǎn)油脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)60 h后通過酸熱法提取油脂，以油脂得率為指標，考察培養(yǎng)基中不同的碳源、氮源、無機鹽質(zhì)量分數(shù)以及pH等因素對發(fā)酵的影響，優(yōu)化油楊樹產(chǎn)脂內(nèi)生真菌的實驗室發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

油楊樹產(chǎn)脂內(nèi)生真菌YM112201，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研發(fā)中心分離純化，保存于PDA培養(yǎng)基中[2]。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)脂工藝流程[3] 菌種→斜面活化→種子液→發(fā)酵培養(yǎng)→油脂提取與檢測。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 ①固體培養(yǎng)基。馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%（均為質(zhì)量分數(shù)，下同），pH自然，滅菌條件為121 ℃、30 min。②優(yōu)化搖床種子培養(yǎng)基[4]。葡萄糖4%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.2%，pH 5.5，培養(yǎng)條件為裝液量50%，接種量10%，30 ℃、105 r/min、18 h。③基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[5]。葡萄糖4%、酵母膏0.4%、硫酸鎂0.5%、硝酸鉀0.9%、磷酸二氫銨0.3%、硫酸銨0.6%，pH 5.5，培養(yǎng)條件為30 ℃、120 r/min、60 h，接種量10%，裝液量40%。

1.2.3 指標測定 ①生物量。將搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)物經(jīng)離心取沉積物（濕菌體），50 ℃下干燥1 h得到干菌體，生物量=干菌體質(zhì)量（g）/發(fā)酵液體積（L）[6]。②油脂的提取和測定。稱取5 g干菌體，加入30 mL 4 mol/L的鹽酸，振蕩混合，室溫放置30 min后沸水浴3 min，低溫速冷，重復(fù)2次，再加入2倍體積的氯仿—甲醇（體積比1∶1）混勻，5 000 r/min離心10 min，取氯仿層，揮發(fā)去除氯仿后得油脂[7，8]。

油脂得率=油脂質(zhì)量/菌體干重×100%

1.2.4 單因素試驗 設(shè)置單因素試驗分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機鹽質(zhì)量分數(shù)及pH對菌體發(fā)酵后生物量及油脂得率的影響。①葡萄糖。培養(yǎng)基中碳源葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)分別為1%、2%、4%、6%、7%、8%、9%、10%。②酵母膏。培養(yǎng)基中酵母膏的質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%。③硫酸鎂。培養(yǎng)基中硫酸鎂的質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%。④硝酸鉀。培養(yǎng)基中硝酸鉀的質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、1.5%。⑤磷酸二氫銨。培養(yǎng)基中磷酸二氫銨的質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%。⑥硫酸銨。培養(yǎng)基中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%。⑦pH。培養(yǎng)基pH分別為4.5、4.9、5.3、5.7、6.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖質(zhì)量分數(shù)對油脂得率和菌體生物量的影響

葡萄糖是最適合細胞生長與油脂合成的碳源，本試驗以葡萄糖作為碳源，考察其在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分數(shù)對菌體生物量和油脂得率的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，隨著葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的升高，菌體生物量和油脂產(chǎn)量先升高，在葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為8%時達到最高，之后下降。葡萄糖濃度過低會導(dǎo)致細胞生長缺乏足夠的碳源，但葡萄糖濃度過高則會導(dǎo)致發(fā)酵液黏稠，傳質(zhì)狀況差，大量能量被消耗于非生產(chǎn)用途，造成浪費，對產(chǎn)物的合成不利。另外，過高的葡萄糖濃度會產(chǎn)生過高的滲透壓，也會抑制菌體的生長。

2.2 酵母膏質(zhì)量分數(shù)對油脂得率和菌體生物量的影響

培養(yǎng)基中氮源濃度和碳氮比是影響菌體油脂含量的主要因素。一般來說，培養(yǎng)基中含氮化合物越多則細胞蛋白質(zhì)含量越多，因此在實際生產(chǎn)中，培養(yǎng)初期供給量較大的氮源使微生物迅速增殖以獲得大量菌體細胞，后期改為含糖量多的培養(yǎng)條件以使油脂積累，提高油脂含量。酵母膏為天然有機氮源，培養(yǎng)基中酵母膏質(zhì)量分數(shù)對油脂得率和菌體生物量的影響結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，菌體生物量和油脂得率都隨酵母膏質(zhì)量分數(shù)的升高呈先升后降的趨勢，酵母膏的質(zhì)量分數(shù)為0.6%時油脂得率最高，為20.94%。培養(yǎng)基中含氮量增加會使油脂積累量升高，但氮源濃度過高時菌體不能順利地實現(xiàn)從生長型到產(chǎn)物積累型的轉(zhuǎn)變，會出現(xiàn)抑制油脂積累的現(xiàn)象。

2.3 硫酸鎂對油脂得率和菌體生物量的影響

鎂離子是某些酶的輔基或激活劑，其對核糖體、核酸、細胞膜有穩(wěn)定作用。培養(yǎng)基中鎂離子質(zhì)量分數(shù)不同時菌體生物量和油脂得率均有較大變化（圖3）。從圖3可以看出，當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為0.7%時油脂得率最大，為25.81%，而當(dāng)硫酸鎂濃度高于0.7%時，油脂得率降低，可能是過多的鎂離子與培養(yǎng)基中的氨氮以及磷酸根結(jié)合，抑制微生物的生長與代謝。

2.4 硝酸鉀對油脂得率和菌體生物量的影響

硝酸鉀可以作為速效氮源供細胞使用，且鉀離子與細胞透性有關(guān)，其含量變化也會對菌體的生長和代謝造成影響。硝酸鉀質(zhì)量分數(shù)對菌體生物量和油脂得率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，當(dāng)硝酸鉀質(zhì)量分數(shù)為0.5%時油脂得率最高，為32.92%。由于菌體生長時需要的鉀離子濃度低于產(chǎn)脂時的需要量，故在試驗范圍內(nèi)硝酸鉀質(zhì)量分數(shù)升高，菌體生物量會降低。

2.5 磷酸二氫銨對油脂得率和菌體生物量的影響

磷主要以H2PO4-形式加入，是核酸、蛋白質(zhì)等重要細胞物質(zhì)的組成部分，又是許多輔酶、高能磷酸鍵的組成部分，因此磷在菌體生長、繁殖和代謝活動中起著極其重要的作用。磷酸二氫銨質(zhì)量分數(shù)對菌體生長和油脂積累的影響結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，磷酸二氫銨質(zhì)量分數(shù)為0.4%時油脂得率最高，為38.40%。磷元素有利于糖代謝的進行，能促進微生物的生長，但其添加量過多會抑制某些酶的活性，對產(chǎn)物的合成有抑制作用。

2.6 硫酸銨對油脂得率和菌體生物量的影響

銨離子在油脂合成中是必需的，常以硫酸銨的形式加入，同時銨鹽也可以作為無機氮源。硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對菌體生長和油脂積累的影響結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為0.4%時油脂得率最高，為46.01%。硫酸銨作為一種生理酸性物質(zhì)被微生物迅速利用后產(chǎn)生硫酸，使pH下降，從而抑制了生物量與油脂得率的升高。

2.7 pH對油脂得率和菌體生物量的影響

真菌的生長和代謝合成油脂的過程均對pH有著嚴格的要求。從圖7可以看出，pH為5.3時菌體生物量和油脂得率都較高，油脂得率為49.88%，pH高于5.3時菌體生物量升高但油脂得率下降。

3 結(jié)論

通過單因素試驗考察了培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機鹽的質(zhì)量分數(shù)和pH對高產(chǎn)油楊樹內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)油脂過程中菌體生物量和油脂得率的影響。結(jié)果表明，優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中各營養(yǎng)元素的質(zhì)量分數(shù)分別為葡萄糖8%、酵母膏0.6%、硫酸鎂0.7%、硝酸鉀0.5%、磷酸二氫銨0.4%、硫酸銨0.4%，適宜的pH為5.3，此時油脂得率為49.88%。

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（責(zé)任編輯 向 闈）