摘要：研究了重金屬Cd2+對中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的生長以及藻細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，以及谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素（Car）及丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果表明，Cd2+對中肋骨條藻生長的72 h 半效應(yīng)濃度（EC50）為378 μg/L。藻細(xì)胞GSH含量隨Cd2+濃度的升高而迅速升高，峰值出現(xiàn)在800 μg/L，當(dāng)Cd2+濃度大于800 μg/L時(shí)GSH含量略呈下降趨勢，但其含量仍高于對照；Car含量則隨Cd2+濃度的升高持續(xù)下降。Cd2+濃度為100 μg/L時(shí)SOD活性達(dá)峰值，較對照上升了26.8%（P<0.05）；APX活性則隨Cd2+濃度升高的變化相對平緩；暴露時(shí)間試驗(yàn)中，觸毒6 h時(shí)SOD活性達(dá)峰值。在Cd2+脅迫下藻細(xì)胞膜脂被氧化自由基所氧化，產(chǎn)生大量的MDA。結(jié)果顯示，中肋骨條藻細(xì)胞的SOD、APX活性和MDA含量與水體中的Cd2+濃度具明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：Cd2+；中肋骨條藻（Skeletonema costatum）；毒性效應(yīng)

中圖分類號：Q949.27 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5428-04

Toxicity Effects of Cd2+ to Skeletonema costatum

ZHENG Wei1，2，LI Xin-shu1，2，HE Pei-min2

（1.School of Marine Science and Technology， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005， Jiangsu， China；

2.College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract：The effects of heavy metal Cd2+ on the growth of Skeletonema costatum and the content of superoxide dismutase （SOD）， ascorbate peroxidase （APX）， glutathione （GSH）， carotenoids （Car） and malondialdehyde （MDA） in the algal cells were studied. The results showed that the 72 h EC50 of Cd2+ on the growth of S. costatum was 378 μg/L. The GSH content increased as the Cd2+ concentration increasing， and arrived the highest GSH content with 800 μg/L Cd2+. The GHS decreased when the Cd2+ concentration was larger than 800 μg/L， but still higher than the control. The Car content decreased as the Cd2+ concentration increasing. The SOD activity arrived the highest with 100 μg/L Cd2+， and increased 26.8%（P<0.05） comparing to the control. The APX activity changed relatively less with Cd2+ concentration increasing. In the exposing experiment， the SOD activity arrived the highest after 6 hours. Under the stress of Cd2+， the algal cell membrane lipids were oxidated by oxygen free radicals， resulting in a large number of MDA. Generally， the SOD， APX activity and MDA content of S. costatum were significantly correlated with the Cd2+ concentration in the water.

Key words：Cd2+； Skeletonema costatum； toxicity effects

近年來，中國近海海洋環(huán)境遭受了前所未有的污染，嚴(yán)重?fù)p害了海洋的環(huán)境和資源，造成了近岸漁業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的衰退、生物種類銳減、水產(chǎn)品健康質(zhì)量下降[1]。海洋微藻是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)餌料，同時(shí)對重金屬的轉(zhuǎn)移、分配和歸趨等具有重要作用。與水生動(dòng)物相比，海洋微藻對重金屬脅迫更加敏感，并且具有生長周期短、易于分離培養(yǎng)和可直接觀察細(xì)胞水平上的中毒癥狀等優(yōu)點(diǎn)，是較為理想的試驗(yàn)材料[2，3]。有研究認(rèn)為，海洋生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)可以作為監(jiān)測海洋污染狀況的生物標(biāo)志物[4]。目前，有關(guān)環(huán)境壓力與海洋微藻的抗氧化防御系統(tǒng)之間關(guān)系的研究相對較少。Cd是一種具有潛在危害的重金屬，在水環(huán)境中非常穩(wěn)定，除了直接影響藻類及其他水生植物外，對整個(gè)水生食物網(wǎng)也具有潛在的威脅。中肋骨條藻（Skeletonema costatum）是重要的生物餌料，在海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛。本試驗(yàn)研究了重金屬Cd2+脅迫下中肋骨條藻的生物學(xué)效應(yīng)，并從活性氧化自由基的角度探討了重金屬對海洋微藻毒性的可能機(jī)制，以期對海洋環(huán)境監(jiān)測和海洋環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中肋骨條藻由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。CdCl2·2.5H2O為分析純，購自上海振欣試劑廠。用無菌水配制CdCl2母液（156 mmol/L），備用。試驗(yàn)海水取自江蘇省連云港連島海區(qū)（海水中的Cd2+濃度為0.152 μg/L），黑暗沉淀7 d后用0.45 μm的濾膜過濾，煮沸消毒，冷卻后用來配制培養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

微藻培養(yǎng)液選用f/2營養(yǎng)鹽配方[5]，略有改進(jìn)。為減少配方中各元素對重金屬的影響，不添加原配方中的EDTA和微量元素；為維持pH值相對穩(wěn)定，另加緩沖劑1 g/L NaHCO3、10 mg/L尿素。培養(yǎng)條件：光照度3 000～3 500 lx，光源為日光燈，光暗比為12 h∶12 h，pH為（8.3±0.2），鹽度為（3.02±0.05）%，溫度為（21.0±0.5） ℃，于指數(shù)生長期接種，均為一次性培養(yǎng)，中間不加營養(yǎng)鹽。用于培養(yǎng)微藻的三角燒瓶先在稀鹽酸中浸泡數(shù)日，再分別用相應(yīng)濃度的Cd2+培養(yǎng)液預(yù)平衡48 h，以消除試驗(yàn)過程中容器壁的吸附作用，培養(yǎng)時(shí)每天充分搖瓶3～5次，并隨機(jī)交換位置以減少光照可能引起的誤差。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)培養(yǎng)結(jié)果，設(shè)置100、200、400、800和1 600 μg/L 5個(gè)Cd2+濃度組，另設(shè)1個(gè)對照組（0 μg/L），每組3個(gè)平行。在暴露時(shí)間試驗(yàn)中，以72 h半效應(yīng)濃度（EC50）的近似值作為試驗(yàn)濃度，分別于暴露后3、6、12、24、48、96 h測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，試驗(yàn)重復(fù)1次。

1.3 生物效應(yīng)指標(biāo)測定

1.3.1 細(xì)胞密度和相對增長率（K）測定 細(xì)胞密度測定用盧戈氏液固定，采用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，取平均值。相對增長率計(jì)算方法參見文獻(xiàn)[6]，用直線內(nèi)插法[7]求得72 h EC50值。

1.3.2 類胡蘿卜素（Car）含量測定 類胡蘿卜素含量的測定參照文獻(xiàn)[8]，90%丙酮提取后，用日本島津UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)測定。

1.3.3 谷胱甘肽（GSH）含量測定 谷胱甘肽含量的測定參照文獻(xiàn)[9]，以DTNB顯色，在412 nm下檢測。

1.3.4 SOD活性測定 粗酶液制備：取待測藻液20 mL，于5 000 r/min下離心10 min，去上清液，沉淀中加入適量0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），超聲波破碎藻細(xì)胞；破碎液于4 ℃ 6 500 r/min下離心20 min，上清液即為粗酶液。SOD活性測定采用Beauchamp等[10]建立、Bewley[11]改進(jìn)的氮藍(lán)四唑（NBT）光化學(xué)還原反應(yīng)法。反應(yīng)結(jié)束后，利用日本島津UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)在560 nm處測定吸光度，測定時(shí)用0.1 mL磷酸緩沖液代替粗酶液測得對照組吸光度。1個(gè)酶活力單位（U）定義為能引起反應(yīng)初速度（不加酶時(shí)）半抑制時(shí)的酶用量。

1.3.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定 抗壞血酸過氧化物酶活性的測定參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，以1 min氧化1 μmol抗壞血酸（AsA）的酶量為1個(gè)抗壞血酸過氧化物酶活力單位（U）。

1.3.6 丙二醛（MDA）含量的測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法[13，14]進(jìn)行定量測定：取適量粗酶液加入到含有0.5%硫代巴比妥酸（TBA）的20%三氯乙酸溶液中，混合后于100 ℃下水浴30 min，迅速冷卻，4 000 r/min離心10 min，上清液分別于532 nm、600 nm處測定吸光度。藻細(xì)胞MDA含量的單位為μmol/個(gè)，按文獻(xiàn)[15]的方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，并進(jìn)行t檢驗(yàn)和差異顯著性分析，用Excel 2003繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+脅迫對中肋骨條藻生長的影響

由圖1可見，Cd2+脅迫下各處理組的中肋骨條藻生長均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且隨著Cd2+濃度增大微藻細(xì)胞密度的增長趨于緩慢，1 600 μg/L Cd2+處理組細(xì)胞密度48 h時(shí)比24 h時(shí)上升了5.4%，72 h時(shí)比48 h時(shí)下降了4.1%，表明中肋骨條藻在高濃度Cd2+的脅迫下出現(xiàn)了死亡。

由圖2可見，Cd2+脅迫下各處理組中肋骨條藻的相對增長率隨著Cd2+濃度的增大迅速降低，72 h時(shí)800 μg/L Cd2+處理組的K值為0.101，1 600 μg/L Cd2+處理組的K值為-0.035。Cd2+脅迫72 h時(shí)100 μg/L處理組K值與對照相比差異顯著（P<0.05），200 μg/L處理組K值與對照相比差異極顯著（P<0.01）。用直線內(nèi)插法求得Cd2+對中肋骨條藻生長的72 h EC50為378 μg/L。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的毒物對生物非但無害而且表現(xiàn)為刺激生長的作用，這種現(xiàn)象被稱為毒物興奮效應(yīng)（Hormezis）[16]。本研究結(jié)果表明，低濃度Cd2+對中肋骨條藻表現(xiàn)出一定的刺激效應(yīng)，對藻細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)作用。

2.2 Cd2+脅迫對中肋骨條藻中GSH和Car含量的影響

如圖3所示，隨著Cd2+濃度的升高，中肋骨條藻GSH含量逐漸升高，峰值出現(xiàn)在800 μg/L，其GSH含量比對照升高了68.2%（P<0.05）；當(dāng)Cd2+濃度大于800 μg/L時(shí)GSH的含量又略呈下降趨勢， 但其含量仍比對照高；Cd2+濃度為1 600 μg/L時(shí)GSH含量仍然比對照升高了62.1%（P<0.05）。類胡蘿卜素的含量則隨Cd2+濃度的升高而持續(xù)下降，濃度為1 600 μg/L時(shí)類胡蘿卜素含量比對照下降了31.3%（P<0.05）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在低濃度Cd2+脅迫下，谷胱甘肽含量被誘導(dǎo)升高；而在較高濃度Cd2+處理下，谷胱甘肽含量又略呈下降趨勢，但仍維持在較高水平；類胡蘿卜素的含量則隨Cd2+濃度升高逐漸下降且變化幅度不大。谷胱甘肽是生物體內(nèi)普遍存在的還原性物質(zhì)，其在維持膜結(jié)構(gòu)的完整性、清除植物體內(nèi)的活性氧和防御膜脂被自由基氧化中起關(guān)鍵作用；類胡蘿卜素既是植物體的光合色素和內(nèi)源抗氧化劑，在猝滅活性氧方面同樣具有重要作用[17]。有研究認(rèn)為，谷胱甘肽在抗氧化方面的作用大于類胡蘿卜素[18]，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，即在低濃度Cd2+作用下，谷胱甘肽的含量被誘導(dǎo)迅速升高。

2.3 Cd2+脅迫對中肋骨條藻SOD、APX活性的影響

由圖4可見，中肋骨條藻SOD活性隨Cd2+濃度升高的變化趨勢是在低濃度時(shí)表現(xiàn)出應(yīng)激性上升，峰值出現(xiàn)在100 μg/L Cd2+濃度組，Cd2+濃度大于100 μg/L時(shí)SOD活性逐漸降低，Cd2+濃度大于400 μg/L時(shí)表現(xiàn)出對SOD活性的抑制效應(yīng)。100 μg/L Cd2+處理組的SOD活性較對照上升了26.8%（P<0.05）；400 μg/L Cd2+處理組的SOD活性較對照降低了0.5%；而1 600 μg/L Cd2+處理組的SOD活性則較對照降低了47.9%（P<0.05）。APX的活性隨Cd2+濃度升高的變化趨勢與SOD的較為相似，但變化幅度較SOD相對平緩，峰值出現(xiàn)在200 μg/L Cd2+濃度組，較對照升高了18.3%（P<0.05）。與對照組相比，Cd2+濃度大于400 μg/L時(shí)APX活性開始降低，且降低速度較快，800、1 600 μg/L Cd2+處理組的APX活性較對照分別降低了17.7%（P<0.05）和38.0%（P<0.05）。結(jié)果表明，中肋骨條藻 SOD、APX活性受Cd2+脅迫的變化趨勢表現(xiàn)為在低濃度時(shí)應(yīng)激性升高，高濃度時(shí)逐漸降低，表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，對Cd2+的敏感性APX較SOD低。

SOD和APX是植物體細(xì)胞重要的抗氧化酶。相關(guān)研究結(jié)果表明，在低濃度的重金屬脅迫作用下，藻類細(xì)胞的SOD活性不僅沒有下降，反而被誘導(dǎo)上升，說明藻細(xì)胞可以通過增加其SOD等抗氧化防御系統(tǒng)的能力來削弱活性氧的脅迫；在高濃度的重金屬脅迫作用下，藻類細(xì)胞的SOD活性呈逐漸降低的趨勢，表明細(xì)胞清除活性氧的能力進(jìn)一步下降，進(jìn)而有可能對細(xì)胞造成更大的損傷[19]。隨著Cd2+濃度的升高，APX活性先上升，然后又逐漸下降，說明低濃度的Cd2+對APX的活性有誘導(dǎo)作用；但當(dāng)Cd2+濃度大于400 μg/L時(shí)，對APX活性則有抑制效應(yīng)。Cd2+對中肋骨條藻SOD活性的作用與APX相似，即低濃度時(shí)酶活性上升，高濃度時(shí)酶活性下降。

2.4 Cd2+處理時(shí)間對中肋骨條藻SOD活性的影響

試驗(yàn)將中肋骨條藻培養(yǎng)于378 μg/L（72 h EC50）的Cd2+培養(yǎng)液中，結(jié)果見圖5。由圖5可知，中肋骨條藻在暴露3 h時(shí)其SOD活性被誘導(dǎo)而迅速升高，是對照的2.01倍（P<0.05）；暴露6 h時(shí)SOD活性達(dá)到峰值，是對照的2.76倍（P<0.05）；但96 h時(shí)的SOD活性低于對照水平，比對照下降了29.7%（P<0.05）。對照組SOD活性隨時(shí)間變化不明顯。

用72 h EC50濃度的Cd2+處理中肋骨條藻，其SOD活性隨時(shí)間變化的關(guān)系表明，在最初的數(shù)小時(shí)內(nèi)SOD活性被誘導(dǎo)而快速升高，隨后逐漸降低。在低濃度Cd2+脅迫下，中肋骨條藻的APX、SOD都維持較高活性（圖4），中肋骨條藻仍能維持生長（圖1、圖2）。這進(jìn)一步說明Cd2+脅迫對微藻生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)的影響是由多種酶和其他活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。單一酶的活性升高對藻類細(xì)胞無明顯的益處，相反，只要有一種酶活性顯著下降時(shí)就有可能降低細(xì)胞的抗氧化防御能力，對抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生較強(qiáng)的影響。

2.5 Cd2+脅迫對中肋骨條藻MDA含量的影響

由圖6可見，中肋骨條藻MDA含量隨著Cd2+濃度的升高而逐漸升高，但Cd2+濃度大于400 μg/L時(shí)MDA含量略有下降，峰值出現(xiàn)在400 μg/L濃度組，是對照的3.72倍（P<0.05）；1 600 μg/L處理組MDA含量為對照的3.02倍（P<0.05）。表明在Cd2+脅迫下中肋骨條藻細(xì)胞膜脂被氧化自由基所氧化，產(chǎn)生了大量的MDA。

生物體的膜脂過氧化程度常通過測定其氧化產(chǎn)物MDA的含量進(jìn)行衡量，即膜脂過氧化增強(qiáng)，其產(chǎn)物MDA含量就會增加[20]。試驗(yàn)結(jié)果表明，Cd2+濃度小于400 μg/L時(shí)，MDA含量與溶液中的Cd2+濃度呈正相關(guān)，而Cd2+濃度大于400 μg/L時(shí)則呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與Cd2+脅迫對青島大扁藻MDA含量的影響結(jié)果一致[21]。

3 結(jié)論

Cd2+對中肋骨條藻的生長呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，Cd2+對中肋骨條藻生長的72 h EC50為378 μg/L，當(dāng)Cd2+濃度大于400 μg/L時(shí)，對SOD和APX活性有抑制效應(yīng)；Cd2+濃度小于400 μg/L時(shí)，MDA含量與Cd2+的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。鑒于中肋骨條藻細(xì)胞的SOD、APX活性和MDA含量與水體中的Cd2+濃度具有明顯的相關(guān)性，因此SOD和APX活性及MDA含量是監(jiān)測水體中Cd2+污染的良好生物標(biāo)志物。

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（責(zé)任編輯 張利艷）