摘要：以新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）TS09耐熱株為研究對象，研究了該毒株在幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK細(xì)胞）上的培養(yǎng)適應(yīng)性。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化、連續(xù)傳代培養(yǎng)和極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應(yīng)BHK細(xì)胞的NDV耐熱株，命名為TS09-C株。TS09-C株的生物學(xué)特性測定結(jié)果表明，TS09-C株在BHK細(xì)胞中的增殖滴度為107.9 TCID50/mL，平均雞胚致死時(shí)間（MDT）大于120 h，腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）為0。與親本株TS09株相比，TS09-C株的基因序列發(fā)生了較為明顯的改變，但TS09-C株與親本株仍保持著較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）；耐熱；BHK細(xì)胞；傳代

中圖分類號(hào)：S852.65+9.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5424-04

Serial Passages Culture of Newcastle Disease Virus Thermostable TS09 Strain in BHK Cells

WEN Guo-yuan1，SHANG Yu1，2，GUO Jing1，2，YANG Jun1，WANG Hong-lin1，LUO Qing-ping1，

ZHANG Rong-rong1，SHAO Hua-bin1

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China；

2. College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

Abstract： The characterization study of Newcastle disease virus （NDV） thermostable TS09 strain following serial passages in BHK cells was carried out. After optimization of the culture conditions， serial passages in BHK cells and purification by End-point dilutions， a newly purified， BHK cell-adapted NDV thermostable strain was developed， named TS09-C strain. Results from the biological characterization tests showed that the titer of TS09-C strain in BHK cells was 107.9 TCID50/mL， MDT>120 h and ICPI was 0. It was demonstrated that there were a number of mutations in the genome of TS09-C strain， as compared with the TS09 strain. However， the close genetic relationships among the TS09-C and TS09 strains were observed.

Key words： Newcastle disease virus（NDV）； thermostable； BHK cells； serial passages

新城疫病毒 （Newcastle disease virus，NDV）為副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒屬（Paramyxovirus）成員，是有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒。由NDV引起的新城疫（Newcastle disease，ND）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的高度接觸性傳染病，死亡率為90%以上，被國際獸疫局認(rèn)定為兩種A類禽病之一（另一種為禽流感）[1]。ND的防控以免疫預(yù)防為主，當(dāng)前國際上生產(chǎn)和使用的ND疫苗有兩大類，即活疫苗和滅活疫苗，活疫苗又包括低毒力和中等毒力活疫苗[2]。中等毒力活疫苗免疫效果優(yōu)良，抗體一致性好，但對雛雞、鴿和鵪鶉等有較強(qiáng)的毒副作用，此類疫苗免疫的禽肉不符合出口要求；滅活疫苗使用安全、免疫效果好，但需要肌肉注射，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，免疫成本高，且影響禽肉品質(zhì)，使其應(yīng)用受到了一定的限制；低毒力活疫苗以其使用方便（可通過拌料、飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射等多種方式給苗）和毒副作用較小等優(yōu)點(diǎn)在我國應(yīng)用最為廣泛。但低毒力活疫苗耐熱性能較差和冷藏條件要求高，常因保存或使用不當(dāng)而影響疫苗免疫效果，不利于在我國氣溫普遍較高的南方地區(qū)和冷藏條件較差的農(nóng)村進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用。因此，以V4株為代表的ND低毒力耐熱活疫苗在我國有著較為廣闊的應(yīng)用前景[3，4]。

當(dāng)前，包括耐熱株在內(nèi)的ND疫苗生產(chǎn)主要是使用雞胚，而以普通雞胚生產(chǎn)疫苗就可能使疫苗在生產(chǎn)過程中污染一些可由雞胚垂直傳播的疫病病原，導(dǎo)致這些病原隨著疫苗的使用而廣泛傳播。使用異源傳代細(xì)胞制備ND疫苗可避免雞胚傳播其他疫病的風(fēng)險(xiǎn)，關(guān)于NDV在各種細(xì)胞中的增殖研究國內(nèi)外均有報(bào)道[5-8]。研究表明，NDV可在雞胚尿囊液中復(fù)制并產(chǎn)生感染性的病毒粒子，NDV強(qiáng)毒株可在多種體外培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制，但是弱毒株只能在含有胰蛋白酶的細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制[9]。但迄今為止，關(guān)于NDV耐熱株在異源細(xì)胞中傳代培養(yǎng)的系統(tǒng)研究（包括毒株生物學(xué)特性的改變、基因序列的變異等）尚未見報(bào)道。

該研究在已經(jīng)通過雞胚選育得到NDV TS09耐熱株，并在對HN基因進(jìn)行測定分析的基礎(chǔ)上[10]，進(jìn)一步開展了TS09株在幼倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK細(xì)胞）中的傳代培養(yǎng)研究。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化、連續(xù)傳代培養(yǎng)及極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應(yīng)BHK細(xì)胞的NDV耐熱株，并對該毒株的生物學(xué)特性和部分基因序列進(jìn)行了研究。為今后以異源傳代細(xì)胞生產(chǎn)NDV耐熱疫苗奠定了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為NDV耐熱株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立提供了合適的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 NDV毒株

NDV TS09株由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所對NDV V4株經(jīng)雞胚耐熱選育、純化后獲得，為雞胚尿囊液，病毒含量為108.6 EID50/mL。

1.2 試劑與材料

BHK細(xì)胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；9～11日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar公司；DMEM細(xì)胞營養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自Hyclone公司；TPCK-胰酶（接種病毒用）購自Sigma公司；0.5%雞紅細(xì)胞按常規(guī)方法配制。RNA抽提試劑盒和DNA純化試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；dNTPs、Taq酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒接種傳代培養(yǎng)

BHK細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及NDV TS09株的細(xì)胞接種均參照文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行。

1.4 NDV TS09-C株的生物學(xué)特性測定

NDV TS09-C株的生物學(xué)特性測定，如平均雞胚致死時(shí)間（MDT）、腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）、血凝活性效價(jià)（HA）、半數(shù)細(xì)胞感染劑量（TCID50）和半數(shù)雞胚感染劑量（EID50）等，均參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行。

1.5 NDV TS09株和TS09-C株F、HN基因的擴(kuò)增與測序

根據(jù)GenBank已發(fā)表的新城疫病毒HB92株（GenBank登錄號(hào)：AY225110）的F和HN基因序列，設(shè)計(jì)兩對引物，引物序列見表1。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別擴(kuò)增全長的F和HN基因，基因大小分別為1 791 bp和2 002 bp。

病毒基因組RNA的提取參照試劑盒說明書進(jìn)行，提取的RNA溶解于17 μL DEPC水，加入1 μL逆轉(zhuǎn)錄引物，75 ℃ 5 min后立即冰浴，然后加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5×RT Buffer 5 μL、dNTPs（10 mmol/L） 1 μL和M-MLV 1 μL。42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，-20 ℃保存。

PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 3 μL，dNTPs （10 mmol/L） 1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Taq酶（5 U/μL） 1 μL，RT PCR產(chǎn)物5 μL，補(bǔ)去離子水至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將特異性陽性條帶用DNA純化試劑盒純化回收，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.6 NDV TS09-C株F、HN基因的序列分析

使用DNAStar中的MegAlign程序?qū)塑账嵝蛄羞M(jìn)行同源性分析。遺傳進(jìn)化分析由MEGA 4.0軟件完成，采用鄰近歸并法（the Neighbour-joining method）進(jìn)行構(gòu)建，參數(shù)為：Kimura雙參數(shù)（the Kimura two-parameter model）模型和Bootstrap值為100[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶最適濃度的優(yōu)化

在不添加胰蛋白酶的情況下，將NDV TS09株接種于BHK細(xì)胞，進(jìn)行5次連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞病變和測定HA效價(jià)。結(jié)果均未出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，也未檢測出HA活性。以含有不同濃度胰蛋白酶（0.05～20.00 μg/mL）的維持液分別對生長至致密單層的BHK細(xì)胞進(jìn)行維持培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)。胰蛋白酶濃度在高于0.50 μg/mL的情況下，細(xì)胞在24 h內(nèi)即可發(fā)生明顯的病變和死亡。在低于0.50 μg/mL的情況下，細(xì)胞無典型的病變。因此，胰蛋白酶對BHK細(xì)胞的最大無毒濃度為0.20 μg/mL（表2）。

2.2 NDV TS09耐熱株在BHK細(xì)胞中的傳代培養(yǎng)

以含0.20 μg/mL胰蛋白酶的DMEM（不含血清）為接種液和細(xì)胞維持液，將NDV TS09株雞胚毒在BHK細(xì)胞中進(jìn)行17次連續(xù)傳代，除第11、13和15代為極限稀釋法純化病毒外（稀釋度由出現(xiàn)CPE的最高稀釋度決定），其余均為稀釋接種。對傳代病毒進(jìn)行了生物學(xué)特性測定，測定結(jié)果見表3。由表3可知，第2、3代病毒未檢測出HA活性，也無典型CPE出現(xiàn)，第4、5代逐漸出現(xiàn)典型CPE，且HA效價(jià)也上升至23，表明該階段為TS09株在BHK細(xì)胞中的適應(yīng)期；在第6～10代過程中，病毒的HA效價(jià)穩(wěn)定在25，且CPE較為明顯（圖1），表明該階段為TS09株在BHK細(xì)胞中的穩(wěn)定期；在第11～17代中，經(jīng)過3次極限稀釋法純化病毒后，病毒的HA效價(jià)穩(wěn)定在26，且病毒滴度由第10代的106.8 TCID50/mL上升至108.0 TCID50/mL。因此，通過TS09株在BHK細(xì)胞中的17次連續(xù)傳代（包括3次極限稀釋法純化），獲得了一株新的、純化的新城疫病毒細(xì)胞適應(yīng)株，命名為TS09-C株。與親本株相比，TS09-C株的細(xì)胞增殖滴度由103.3 TCID50/mL上升至107.9 TCID50/mL，表明TS09-C株為BHK細(xì)胞適應(yīng)株。此外，MDT和ICPI測定結(jié)果表明，TS09-C株保持了親本株的低毒性。

2.3 NDV TS09-C株F和HN基因的序列測定與分析

采用設(shè)計(jì)的引物對TS09-C株和TS09株的F、HN基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見F和HN基因的特異條帶，與預(yù)期大小結(jié)果一致。將純化后的PCR產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行序列測定，獲得了TS09-C株和TS09株的F、HN基因序列。

對TS09-C株和TS09株的F基因、HN基因序列進(jìn)行比較分析，由結(jié)果（表4）可知，TS09-C與TS09株的F基因、HN基因核苷酸同源性分別為99.7%和93.0%，氨基酸同源性分別為99.5%和96.5%，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)（第112-117位）的氨基酸序列有一處發(fā)生了突變，即G115R。由此可知TS09-C株與親本株相比發(fā)生了較大的基因變異，為新的、純化的新城疫病毒細(xì)胞適應(yīng)株。

2.4 NDV毒株的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用MEGA4.0軟件對包括TS09-C、TS09、V4株在內(nèi)的16株NDV F基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，16個(gè)NDV毒株依據(jù)其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可分為7個(gè)基因亞型，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。分析TS09-C株與TS09親本株及V4株的關(guān)系：TS09-C、TS09和V4株都位于基因Ⅰ型的單獨(dú)一個(gè)分支上，與HB92、I-2等毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果表明TS09-C株仍屬于基因Ⅰ型。此結(jié)果與基于HN基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果基本一致。

3 小結(jié)與討論

將NDV耐熱株適應(yīng)異源傳代細(xì)胞，建立耐熱株的細(xì)胞培養(yǎng)模型，可為今后以異源傳代細(xì)胞生產(chǎn)NDV耐熱活疫苗和建立NDV耐熱株的反向遺傳操作系統(tǒng)打下良好的工作基礎(chǔ)。但是，具有復(fù)雜基因背景的HB92株不適宜作為細(xì)胞適應(yīng)性傳代的母本株。商雨等[10]重新對V4株進(jìn)行雞胚耐熱選育，并以極限稀釋法進(jìn)行純化，獲得了一株新的耐熱性和免疫原性優(yōu)良的NDV毒株TS09株，并以TS09株為親本株開展了細(xì)胞適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。

關(guān)于NDV疫苗株在異源傳代細(xì)胞中傳代培養(yǎng)的研究報(bào)道較多。關(guān)平原等[5]證實(shí)NDV I系毒可以適應(yīng)Vero細(xì)胞并能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。雖然其傳代培養(yǎng)物的HA效價(jià)較低（1∶10～1∶40），但其培養(yǎng)物的TCID50值較高（109.7/0.05 mL）。MDT、EID50測定結(jié)果表明，傳代毒與雞胚毒具有相同的毒價(jià)；古長慶等[13]研究表明，在含10 μg/mL胰蛋白酶時(shí)，在BHK細(xì)胞中傳代的V4株的毒力和HA效價(jià)都明顯提高（1∶512），能達(dá)到其在雞胚上的毒力和效價(jià)；Slosaris等[7]研究報(bào)道，經(jīng)過9～10代的傳代培養(yǎng)，B1株可以適應(yīng)BHK細(xì)胞，但其HA效價(jià)較低（1∶32），病毒滴度僅為2×106.0 PFU/mL。與雞胚毒相比，其毒力明顯上升，MDT由原來的90 h下降為42 h，ICPI由原來的0.21上升至0.60。因此，不同疫苗株在異源細(xì)胞傳代過程中的生物學(xué)特性變化情況并不一致。

在含有0.20 μg/mL胰蛋白酶的培養(yǎng)條件下，將TS09株在BHK細(xì)胞中連續(xù)進(jìn)行了17次傳代（包括三次極限稀釋純化）。在經(jīng)過第1～5代的適應(yīng)階段、第6～10代的穩(wěn)定階段和第11～15代的篩選純化階段后，獲得了一株純化的、適應(yīng)BHK細(xì)胞的耐熱毒株，命名為TS09-C株。與親本株雞胚毒相比，TS09-C株細(xì)胞毒的HA效價(jià)明顯降低（1∶32），其EID50值由原有的108.6/mL下降至105.7/mL，但TCID50值由原有的103.3/mL上升至107.9/mL，充分表明新選育的TS09-C株為細(xì)胞適應(yīng)毒。

通過對TS09-C株和親本株的F、HN基因進(jìn)行序列測定與分析，發(fā)現(xiàn)兩毒株的F基因具有較高的核苷酸同源性（99.7%），但是TS09-C株在其F蛋白裂解位點(diǎn)處發(fā)生一氨基酸突變，即由112GKQGRL117突變?yōu)?12GKQRRL117，此類突變在NDV中尚屬首次發(fā)現(xiàn)（經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST搜索驗(yàn)證）；兩毒株HN基因的核苷酸同源性相對較低，為93.0%。結(jié)合此前的生物學(xué)特性比較結(jié)果，無論是在基因序列方面，還是在生物學(xué)特性方面，TS09-C株已經(jīng)發(fā)生明顯的改變。因此，TS09-C株為一株新的、純化的、適應(yīng)BHK細(xì)胞的耐熱新城疫病毒。但是，TS09-C株仍與親本株、V4株保持著較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

綜上所述，通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化、連續(xù)傳代培養(yǎng)及極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應(yīng)BHK細(xì)胞的NDV耐熱毒株，命名為TS09-C株。對該毒株的生物學(xué)特性和部分基因序列進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，與親本株相比，該毒株的生物學(xué)特性和基因序列已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變，但仍與親本株有較近的進(jìn)化關(guān)系。該研究為今后以異源傳代細(xì)胞生產(chǎn)NDV耐熱疫苗奠定了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為NDV耐熱株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立提供了合適的細(xì)胞模型。

參考文獻(xiàn)：

[1] Office International des Epizoote.Manual for Animal Disease Reporting to the OIE[M]. Paris ：World Organization for Animal Health，1996.

[2] 殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].第二版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[3] 徐振東，孫 莉，周金法，等.新城疫V4克隆株弱毒疫苗研究[J].中國獸醫(yī)雜志，1997，23（8）：48-49.

[4] 夏平安，侯安祖.雞新城疫病毒V4株的生物學(xué)特性研究[J].中國畜禽傳染病，1994（6）：45-46.

[5] 關(guān)平原，梁 英，霍澍田.雞新城疫I系毒在Vero細(xì)胞上的傳代培養(yǎng)[J].中國獸醫(yī)雜志，1993，19（8）：5-7.

[6] 金繼昌，趙立紅，喬 健，等.NDV-Lasota毒株在雞胚成纖維細(xì)胞上的增殖特性[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2007，24（3）：20-23.

[7] SLOSARIS M， LEVY B， KATZ E， et al. Elevated virulence of Newcastle Disease Virus strains following serial passages in kidney cells in vitro[J].Avian Disease，1989（33）：248-253.

[8] WAMBURA P， MEERS J， SPRADBROW P. Development of cell culture method for quantal assay of strain I-2 of Newcastle Disease Virus[J]. Veterinary Research Communications，2006， 30（6）：689-696.

[9] ALLAN W H，LANCASTER J E，TOTH B. Newcastle Disease Vaccine： Their Production and Use[M]. Rome： FAO Animal Production and Health Series，1978.

[10] 商 雨，邵華斌，王紅琳，等.新城疫病毒TS09耐熱株HN基因的序列測定與分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（12）：2543-2547.

[11] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[12] ZHANG R， PU J， SU J L， et al. Phylogenetic characterization of Newcastle disease virus isolated in the mainland of China during 2001-2009[J]. Veterinary Microbiology，2010， 141（3）：246-257.

[13] 古長慶，金寧一，金擴(kuò)世，等.新城疫病毒在不同的細(xì)胞上增殖特性的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2000（10）：5-6.

（責(zé)任編輯 屠 晶）