摘要：主要探討姜黃素（Curcumin，CCM）對(duì)支持細(xì)胞株TM4體外生長(zhǎng)的影響。通過采用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法和TUNNEL法檢測(cè)了5種不同濃度的姜黃素對(duì)小鼠支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響。結(jié)果表明，姜黃素抑制TM4細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，這種作用呈劑量依賴效應(yīng)，當(dāng)用40 μmol/mL的姜黃素處理培養(yǎng)的TM4細(xì)胞時(shí)，MTT法測(cè)得的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和TUNNEL法獲得的細(xì)胞凋亡指數(shù)與對(duì)照組相比均有顯著差異。說明姜黃素在預(yù)防和治療睪丸癌方面有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：姜黃素（Curcumin，CCM）；小鼠TM4細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R730.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5418-03

Effects of Curcumin on TM4 Cell in Mouse Testis Sertoli Cell Line

WANG Qing-zhong

（Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology in Universities of Shandong Province / College of Bio-engineering and Agriculture， Weifang University，Weifang 261061，Shandong，China）

Abstract： The present study was mainly to investigate the effect of curcumin on the in vitro growth of TM4 cells. By morphological observation， MTT method and TUNNEL method， the action of curcumin in 5 different concentrations on TM4 cells cultured in DMEM medium were detected. The results indicated that curcumin could inhibit the growth and proliferation of TM4 cells， and induce the apoptosis of cultured TM4 cells. These effects showed dose-dependent. When the cultured TM4 cells was treated with 40 μmol/mL curcumin， the inhibitory rate of TM4 cells from MTT method and apoptosis index of TM4 cells from TUNNEL method all had significantly differences from the data of control group. These results suggested that the curcumin had application prospects in the prevention and treatment of testicular cancer.

Key words： curcumin； mouse TM4 cells； apoptosis

生姜（Zingiber officinale）是藥食同源植物，具有驅(qū)風(fēng)散寒、健胃止吐、抑菌殺蟲、抗腫瘤等作用。姜黃素（Curcumin，CCM）為姜的重要活性成分之一，廣泛用于食品添加劑和著色劑，具有抗HIV、抗利什曼原蟲、抗細(xì)胞畸變、抑制血小板聚集和血栓形成等多種作用[1，2]，尤其是姜黃素的抗癌活性在近年來受到廣泛重視。研究表明，姜黃素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌等各種癌癥的發(fā)生有抑制和治療作用[3-11]。但關(guān)于姜黃素對(duì)精子發(fā)生和睪丸腫瘤的作用至今未見報(bào)道。TM4細(xì)胞株來源于小鼠睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells），在體外培養(yǎng)中具有支持細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的特性。通過研究姜黃素對(duì)TM4細(xì)胞的影響，可反映其對(duì)哺乳動(dòng)物和人的生精作用及對(duì)睪丸腫瘤發(fā)生的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM、胰蛋白酶（Trypsin）、明膠、MTT（甲基四氫葉酸鹽）等試劑均購于Sigma-Aldrich公司；TUNNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為凱基生物有限公司產(chǎn)品，姜黃素為Acros公司產(chǎn)品；其他一般試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器包括細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（北京鼎國生物有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國Precision Scientific Inc.）、倒置顯微鏡（日本Olympus）、An Thos TH2酶標(biāo)儀（Austria公司）等。

1.2 細(xì)胞株與培養(yǎng)條件

小鼠支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞株由中國科學(xué)院動(dòng)物研究所生殖生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

細(xì)胞培養(yǎng)基是以DMEM為基本培養(yǎng)液，添加 2 mmol/L谷氨酰胺、5% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下進(jìn)行。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將TM4細(xì)胞株分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以5種不同濃度的姜黃素進(jìn)行處理。

1.3 姜黃素儲(chǔ)存液的配制與保存

姜黃素儲(chǔ)存液：稱取姜黃素113.4 mg，加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液10 mL，混勻溶解后過濾除菌，分裝并于 -20 ℃保存。用前以溫水浴解凍，以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.4 MTT比色法檢測(cè)TM4細(xì)胞活性

MTT能被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無此功能。DMSO能溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定活細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM4細(xì)胞，制成5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，依次以終濃度為20、40、60、80、100 μmol/mL的姜黃素培養(yǎng)液分別加入96孔板的各孔內(nèi)，每一濃度設(shè)5個(gè)平行。同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不加姜黃素）及空白組（僅加培養(yǎng)液）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO液200 μL，將培養(yǎng)板置于微孔振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，最后在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD490 nm值。通過下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。

細(xì)胞存活率=[（對(duì)照組OD490 nm-試驗(yàn)組OD490 nm）/（對(duì)照組OD490 nm-空白組OD490 nm）]×100%；抑制率=100%-存活率。

試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。結(jié)果用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 原位末端標(biāo)記法（TUNNEL）檢測(cè)TM4細(xì)胞凋亡

TM4細(xì)胞的處理同上，所不同的是制作成細(xì)胞爬片，載玻片常規(guī)干熱滅菌處理，用前以0.2%明膠包被10 min，然后用PBS洗滌3次后接種細(xì)胞。細(xì)胞的染色按試劑盒說明書進(jìn)行，主要步驟如下：①取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌2次，每次5 min；②加入3%過氧化氫室溫下孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；③0.1%蛋白酶K在4 ℃下作用30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；④加入反應(yīng)混合液，37 ℃濕盒內(nèi)孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min，然后加50 μL POD，繼續(xù)孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min；⑤加入50 μL新配制的DAB顯色試劑作用3～5 min，用自來水洗，置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下檢查姜黃素對(duì)TM4細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

光鏡下，對(duì)照組的TM4細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)呈梭形或多角形，胞核明顯（圖1A）。20 μmol/mL的姜黃素處理組的TM4細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化；40 μmol/mL的姜黃素處理組可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)不良，某些細(xì)胞的胞體變小，變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少（圖1B）；60 μmol/mL的姜黃素處理組中可觀察到大量的細(xì)胞脫壁，輪廓不清晰，細(xì)胞膜破潰，聚集成細(xì)胞團(tuán)以及少量的細(xì)胞碎片（圖1C）?？梢婋S處理劑量的增加，姜黃素可明顯抑制TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。

2.2 MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)TM4細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

MTT法測(cè)定不同濃度的姜黃素對(duì)TM4細(xì)胞株生長(zhǎng)與增殖的影響結(jié)果見表1。由表1可見，20 μmol/mL姜黃素處理的TM4細(xì)胞抑制率與對(duì)照組相比沒有顯著差異，40 μmol/mL姜黃素處理組對(duì)TM4細(xì)胞增殖的抑制作用與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05），隨著姜黃素處理濃度的增大，其抑制作用越來越強(qiáng)，呈劑量依賴性。姜黃素處理濃度達(dá)到100 μmol/mL時(shí)，TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖已基本被抑制。

2.3 TUNNEL法檢測(cè)姜黃素對(duì)TM4細(xì)胞的影響結(jié)果

通過試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡的作用。在20 μmol/mL姜黃素處理下偶見凋亡的細(xì)胞，說明該濃度的姜黃素處理對(duì)TM4細(xì)胞沒有明顯影響（圖2B）；40 μmol/mL姜黃素處理下可觀察到較多的凋亡細(xì)胞，隨著處理濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增大（圖2C）。統(tǒng)計(jì)分析也表明，40 μmol/mL姜黃素處理組與對(duì)照組相比其TM4細(xì)胞凋亡指數(shù)有顯著差異（P<0.05）（表2）。

3 小結(jié)與討論

從生姜中提取的姜黃素具有多方面的藥理作用。尤其是作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌新藥，具有抗癌譜廣、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是潛在的第三代抗惡性細(xì)胞增殖藥[4-11]。許多研究表明，姜黃素具有確切的抗細(xì)胞增殖活性[2，8]，但姜黃素對(duì)睪丸中支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的影響作用還鮮見報(bào)道。

在本研究中，利用小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4作為研究材料，通過光鏡下的細(xì)胞形態(tài)觀察、MTT法測(cè)定細(xì)胞活性和TUNNEL法三種方法研究姜黃素對(duì)TM4細(xì)胞的影響。結(jié)果表明姜黃素可抑制TM4細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與報(bào)道的姜黃素對(duì)其他類型細(xì)胞的影響結(jié)果是一致的，40 μmol/mL的姜黃素即能顯著抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-8]，并呈劑量依賴效應(yīng)。TM4細(xì)胞來源于小鼠的睪丸支持細(xì)胞，既具有支持細(xì)胞的特殊性，又具有腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。這一研究結(jié)果也表明，姜黃素對(duì)睪丸癌細(xì)胞的增殖有抑制和誘導(dǎo)其凋亡的作用。因此，姜黃素可以作為預(yù)防和治療睪丸癌的藥物。但姜黃素誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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