摘要：從GenBank數(shù)據(jù)庫中龍井43的EST序列中篩查EST-SSR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并獲得了65對(duì)茶樹（Camellia sinensis）EST-SSR引物。以鄂茶1號(hào)、龍井43、龍井群體、云抗10號(hào)、雪芽100、矮豐的基因組DNA為模板，對(duì)所設(shè)計(jì)的65對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，65對(duì)引物均能擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率為100%；其中有4對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在6個(gè)樣本間具有多態(tài)性，能用于6個(gè)茶樹品種的品種鑒別。

關(guān)鍵詞：茶樹（Camellia sinensis）；表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）；簡單序列重復(fù)（SSR）；品種鑒別

中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5406-03

Application of EST-SSR Molecular Markers in Tea Varieties Identification

ZHANG Yi，HU Ding-jin

（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： EST-SSR loci were screened from EST sequences of Longjing 43 in the NCBI public database， 65 pairs of EST-SSR primers were designed using Primer 5.0 software. The genomic DNA of tea varieties Hubei No.1 tea， Longjing 43， Longjing groups， Yunkang No.10， Xueya 100 and Aifeng were extracted and used as a template to select EST-SSR primers. The results showed that targeted bands of all the 65 pairs of primers were amplified， the amplification rate was 100%. 4 pairs of EST-SSR primers showed polymorphism in the 6 samples， could be used for identification of the 6 tea varieties.

Key words： tea（Camellia sinensis）； expressed sequence tags（EST）； simple sequence repeats（SSR）； variety identification

茶（Camellia sinensis）是深受廣大消費(fèi)者喜愛的傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品，是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在國際貿(mào)易中也占有較大份額。但目前茶葉市場存在以陳茶代替新茶、低檔茶冒充高檔茶、非地理標(biāo)志產(chǎn)品冒充地理標(biāo)志產(chǎn)品等欺詐行為，嚴(yán)重影響了茶葉市場的運(yùn)作并損害了廣大消費(fèi)者的利益。采用RAPD[1]、AFLP[2]、ISSR[3]、SSR[4]等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)茶樹品種進(jìn)行鑒定和分析，具有重要的研究和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR）是以1～8個(gè)堿基為基本單元的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列由于重復(fù)次數(shù)的不同而形成序列長度的多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建、目標(biāo)基因的標(biāo)定、品種真實(shí)性的鑒定等研究[5，6]。表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）是指對(duì)cDNA文庫隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，與基因組SSR相比，從EST數(shù)據(jù)庫中直接篩選獲得EST-SSR標(biāo)記較為經(jīng)濟(jì)和便捷。隨著茶樹EST研究工作的開展，公共數(shù)據(jù)庫中積累了大量的茶樹EST序列，本研究擬依據(jù)數(shù)據(jù)庫中的茶樹EST序列設(shè)計(jì)SSR引物，建立EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)，并對(duì)地理標(biāo)志茶葉品種進(jìn)行鑒別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2012年4～5月采集鄂茶1號(hào)、龍井43、龍井群體、云抗10號(hào)、雪芽100和矮豐6個(gè)茶樹品種的1芽2葉新梢，其中鄂茶1號(hào)采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所茶園；龍井43及龍井群體采自杭州龍井村茶園；云抗10號(hào)、雪芽100和矮豐采自云南省思茅茶樹良種場茶園。采集的樣本經(jīng)液氮速凍處理后保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹基因組DNA的提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組快速提取試劑盒提取茶樹的基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取基因組DNA的質(zhì)量，用核酸檢測儀測定DNA的濃度和純度，將其稀釋到30～50 ng/μL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 茶樹EST-SSR的開發(fā) 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載龍井43的EST序列，應(yīng)用Staden軟件進(jìn)行聚類和拼接，獲得一致性序列，再去掉該軟件未能剔除的poly（A）n。利用SSRHunter程序?qū)ST序列中所含有的SSR進(jìn)行查找，剔除SSR旁鄰序列小于20 bp的EST后采用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 EST-SSR 的擴(kuò)增與檢測 PCR反應(yīng)體系為20 μL，采用TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix試劑盒，依次加入10 μL 2×Taq PCR Master Mix、1 μL模板DNA、上下游引物各1 μL （10 μmol/L），去離子水補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增在S1000TM Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（200 V、2.5 h），硝酸銀染色法檢測，Bio-Rad凝膠成像儀拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹基因組DNA的提取結(jié)果

采用植物基因組快速提取試劑盒提取所采集茶葉樣品的基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質(zhì)量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，試劑盒法提取的茶樹基因組DNA條帶清晰明亮，長度大于2 300 bp。用核酸檢測儀測定基因組DNA的純度，其OD260 nm/OD280 nm為1.7～1.9，表明基因組DNA純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，將其稀釋到30～50 ng/μL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 茶樹EST-SSR引物的設(shè)計(jì)結(jié)果

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載3 442條龍井43的EST序列，應(yīng)用Staden軟件對(duì)隨機(jī)選取的345條EST序列進(jìn)行聚類和拼接，獲得一致性序列，再去掉該軟件未能剔除的poly（A）n。采用SSRHunter程序?qū)ζ渌械腟SR進(jìn)行查找和分析，SSR的篩選標(biāo)準(zhǔn)為單、二、三、四、五和六核苷酸基元的最小重復(fù)數(shù)分別為18、9、5、4、3和3次（表1），在上述345條EST中發(fā)現(xiàn)了65個(gè)SSR位點(diǎn)。其中以二核苷酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率最高，重復(fù)次數(shù)為22；其次是三核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為14；再次是五核苷酸和六核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)均為10；而最少的是四核苷酸和單核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)分別為6次和3次。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)設(shè)置的主要參數(shù)為：GC含量為45%～65%、退火溫度52～58 ℃、引物長度16～22 bp、預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度100～500 bp，共設(shè)計(jì)了65對(duì)茶樹EST-SSR引物。

2.3 茶樹EST-SSR引物在6個(gè)樣本中的擴(kuò)增結(jié)果

利用65對(duì)茶樹EST-SSR引物對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)65對(duì)引物均能在6個(gè)樣本中成功擴(kuò)增出清晰的產(chǎn)物條帶，其中有4對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在品種間具有多態(tài)性（圖2，圖3）。其余引物沒有獲得多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物，與EST-SSR的保守性和供試材料的遺傳距離較近有關(guān)。從圖2、圖3可以看出，引物12對(duì)6個(gè)茶葉品種進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得5個(gè)大小不同的等位基因，出現(xiàn)了4種基因型組合。引物18在雪芽100中沒有擴(kuò)增出目標(biāo)片段，在其余5個(gè)品種中共獲得3個(gè)位置不同的等位基因。引物20在龍井群體僅擴(kuò)增出一條帶，在其他5個(gè)品種中均擴(kuò)增出2個(gè)目的片段。引物21在6個(gè)品種中共擴(kuò)增出5個(gè)片段大小不同的等位基因，組合成4種不同的基因型。通過上述4對(duì)EST-SSR引物在各個(gè)品種中的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物（等位基因）或等位基因組合可以有效區(qū)別6個(gè)茶樹品種。

3 小結(jié)與討論

茶樹EST-SSR出現(xiàn)的頻率較高，重復(fù)基元類型也較豐富。本研究中查找發(fā)現(xiàn)了單至六核苷酸基元重復(fù)，其中以二核苷酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率最高；其次是三核苷酸重復(fù)、單核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)；而最少的是四核苷酸和單核苷酸重復(fù)，表明茶樹品種龍井43的EST-SSR以二核苷酸重復(fù)為主，這與王麗鴛等[7]、金基強(qiáng)等[8]的研究結(jié)果相一致。使用65對(duì)EST-SSR引物對(duì)6個(gè)不同品種的茶樹材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4對(duì)EST-SSR引物在品種間具有多態(tài)性，能有效地區(qū)分鄂茶1號(hào)、龍井43、龍井群體、云抗10號(hào)、雪芽100、矮豐，根據(jù)其有效擴(kuò)增的條帶數(shù)和條帶位置初步建立了鑒別和區(qū)分上述6個(gè)茶樹品種的EST-SSR圖譜，可為這6個(gè)茶樹品種的鑒定和真?zhèn)巫R(shí)別提供參考依據(jù)。本研究表明EST-SSR分子標(biāo)記在茶樹品種鑒定和真?zhèn)巫R(shí)別方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值和前景。后續(xù)工作將通過研究茶葉產(chǎn)品及其種植環(huán)境中2H、18O、13C、15N等穩(wěn)定同位素豐度的差異特征，結(jié)合EST-SSR指紋圖譜提出適宜茶葉產(chǎn)地溯源的技術(shù)指標(biāo)及產(chǎn)地溯源模型。

參考文獻(xiàn)：

[1] 董媛媛，俞咪娜，李小白，等.EST-SSR和RAPD標(biāo)記檢測油菜遺傳多樣性[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22（5）：611-616.

[2] 黃建安，李家賢，黃意歡，等.茶樹AFLP分子連鎖圖譜的構(gòu)建[J].茶葉科學(xué)，2005，25（1）：7-15.

[3] 林鄭和，陳榮冰，陳常頌，等. ISSR分子標(biāo)記在茶樹遺傳關(guān)系分析中的初步應(yīng)用[J].茶葉科學(xué)，2007，27（1）：45-50.

[4] 劉 振，王新超，趙麗萍，等. 基于EST-SSR的西南茶區(qū)茶樹資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析[J].分子植物育種，2008（6）：100-110.

[5] POWELL W， MACHRAY G C， PROVAN J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J]. Trends Plant Science，1996（1）：215-222.

[6] 李永強(qiáng)，李宏偉，高麗鋒，等. 基于表達(dá)序列標(biāo)簽的微衛(wèi)星標(biāo)記（EST-SSRs）研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5（1）：91-95.

[7] 王麗鴛，姜燕華，段云裳，等.茶樹EST-SSRs分布特征及引物開發(fā)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2009，10（4）：511-516.

[8] 金基強(qiáng)，崔海瑞，陳文岳，等.茶樹EST-SSR信息分析與標(biāo)記建立[J].茶葉科學(xué)，2006，26（1）：17-23.

（責(zé)任編輯 向 闈）