摘要：研究了不同氮源及濃度對(duì)三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生長(zhǎng)、總脂及脂肪酸組成的影響。結(jié)果表明，三角褐指藻在氮源缺乏時(shí)生長(zhǎng)緩慢，表現(xiàn)出油脂積累的特性。以初始濃度大于3.9 mmol/L的氯化銨作為氮源，可以促進(jìn)三角褐指藻生物量和油脂含量的同步增長(zhǎng)。高濃度的尿素有利于三角褐指藻的生長(zhǎng)，但達(dá)到8.0 mmol/L時(shí)脂肪含量下降。不同濃度硝酸鈉都促進(jìn)三角褐指藻的生長(zhǎng)，但不能促進(jìn)脂肪的積累。脂肪酸組成分析表明，單不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例為45%～50%，受各種氮源變化的影響較小，可為生物柴油提供較好的流動(dòng)性。氮源的添加有利于二十碳五烯酸（EPA）和多不飽和脂肪酸（PUFAs）的合成，當(dāng)氯化銨濃度為3.9 mmol/L時(shí)，EPA和PUFAs占總脂肪酸的比例達(dá)到最大，分別為20.4%和26.7%。

關(guān)鍵詞：氮源；三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）；生長(zhǎng)；脂肪；脂肪酸組成

中圖分類號(hào)：Q949.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5311-04

Effects of Nitrogen Sources on the Growth and Lipid Content of

Phaeodactylum tricornutum

WANG Yi，F(xiàn)U Ru，PEI Guo-feng，WANG Hai-ying

（Key Lab for Microorganisms and Biotransformation， South-central University for Nationalities， Wuhan 430074，China）

Abstract：Effects of different nitrogen sources and their concentrations on the growth， total lipids and fatty acids composition of Phaeodactylum tricornutum were studied. The results showed that P. tricornutum growed poorly in cultures without addition of any nitrogen source， but accumulated lipids effectively. The biomass and lipid content of P. tricornutum were promoted simultaneously with more than 3.9 mmol/L of initial ammonium chloride in medium； 8.0 mmol/L of urea enhanced the biomass of algae while decreased the lipid content； in the range of tested concentration， sodium nitrate promoted growth of algae and depressed the accumulation of lipid. The fatty acids composition analysis showed that monounsaturated fatty acid（MPUAs） accounted for 45%～50% of the total fatty acids and was less affected by nitrogen sources， thus provided better mobility for biodiesel. The synthesis of C20∶5（n-3）（EPA） and polyunsaturated fatty acid（PUFAs） were increased with addition of nitrogen sources. With 3.9 mmol/L of ammonium chloride， the ratio of EPA and PUFAs to total fatty acids was the highest， 20.4% and 26.7%， respectively.

Key words： nitrogen sources； Phaeodactylum tricornutum； growth； lipid content； fatty acids composition

微藻具有光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、生物產(chǎn)量高等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最有前途的新型生物柴油原料之一[1，2]。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）在分類學(xué)上隸屬于硅藻門，生長(zhǎng)速度快，油脂含量可達(dá)干重的10.0%～ 31.5%，是一種極具開發(fā)潛力的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)藻種資源[2]。王付冬等[3]報(bào)道三角褐指藻總脂含量隨光照的增強(qiáng)而成上升趨勢(shì)；夏金蘭等[4]報(bào)道三角褐指藻脂肪含量隨培養(yǎng)基中Fe3+濃度而變化，在Fe3+濃度為1×10-4 mol/L時(shí)，其脂質(zhì)含量達(dá)到47.3%。因而改變環(huán)境因子和培養(yǎng)基成分可以調(diào)控三角褐指藻生物量和油脂含量。研究不同氮源及濃度對(duì)1株三角褐指藻的生長(zhǎng)、總脂含量及脂肪酸組成的影響，篩選適宜微藻生長(zhǎng)及油脂積累的氮源，明確其適宜濃度范圍，從而為三角褐指藻的生物質(zhì)能研究開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 三角褐指藻培養(yǎng)

試驗(yàn)用三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)抗生素法制備無菌藻株。種子培養(yǎng)基按照f/2配制，500 mL三角瓶裝300 mL培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)液以10%（V/V）接種量接種于培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)18 d，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，光照度為3 500 lx，光暗比12 h∶12 h，每天光照期間搖瓶3次，并隨機(jī)更換三角瓶位置以避免光照不均。以沒有添加硝酸鈉的f/2培養(yǎng)基作為對(duì)照，選取硝酸鈉﹑氯化銨和尿素做為氮源，分別設(shè)定1.0、2.1、3.9及8.0 mmol/L 4個(gè)濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度做3次平行試驗(yàn)。從接種當(dāng)天開始，每隔1 d取出少量藻液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2 藻細(xì)胞收獲

培養(yǎng)液經(jīng)6 000 r/min離心5 min后棄上清，藻細(xì)胞沉淀用去離子水離心洗滌2次，冷凍干燥后所得藻粉稱重，用于油脂測(cè)定。

1.3 油脂含量測(cè)定

氯仿-甲醇法提取油脂[5]。室溫下0.3 g藻粉加入3 mL提取溶劑（氯仿∶甲醇=2∶1），超聲提取約10 min。然后6 000 r/min離心5 min，取下部油脂層。重復(fù)3～5次，合并所有油脂層溶液于80 ℃水浴蒸干溶劑，然后置40 ℃烘箱中干燥至恒重。油脂含量=（油脂質(zhì)量/干藻粉質(zhì)量）×100%。

1.4 脂肪酸成分及含量測(cè)定方法

1.4.1 脂肪提取與甲酯化 取30.0 mg凍干藻粉，放入帶螺帽的水解管內(nèi)，加2 mL CHCl3-CH3OH混合液（體積比為2∶1），充N2 1 min后密閉封口。超聲萃取3 min （33 kHz，300 W），移出上層清液。重復(fù)3次并合并萃取液，移入帶螺帽試管，加0.3 mL正十七酸內(nèi)標(biāo)液（0.4 g/L，CHCl3-CH3OH溶解）。N2吹干后，加0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液1 mL，充氮密封，迅速混勻后置70～80 ℃水浴皂化15 min。冷卻至室溫后加入三氟化硼甲醇溶液1 mL，充氮密封，振蕩1 min，然后70～80 ℃水浴甲酯化30 min。冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入正己烷2.0 mL，振蕩混勻。再加入飽和NaCl溶液2.0 mL，振蕩后靜置，取上層清液，氮?dú)獯蹈蒣6]。準(zhǔn)確加入正己烷1.0 mL，氮?dú)饷芊?，?zhǔn)備進(jìn)樣。所有操作應(yīng)該在低光照和氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，樣品置于超低溫冰箱中保存，進(jìn)樣前加入飽和NaCl溶液，取上層清液3 μL進(jìn)樣。

1.4.2 氣相色譜測(cè)定脂肪酸含量 Agilent6890N氣相色譜儀，毛細(xì)管色譜柱HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，5% Phenyl Siloxane）。進(jìn)樣口溫度250 ℃，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度為300 ℃，載氣N2流量1.0 mL/min，分流比為30∶1?？諝饬髁?50 mL/min，H2流量30 mL/min。柱溫程序升溫：第一段，起始溫度150 ℃，10 ℃/min升溫至210 ℃；第二段，柱溫210 ℃，3 ℃/min升溫至250 ℃，恒溫25 min。以面積歸一化法得到各脂肪酸組分的相對(duì)百分含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源及濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響

氮源及其濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響見圖1，從生長(zhǎng)曲線可知不添加氮源時(shí)微藻生長(zhǎng)緩慢。試驗(yàn)各濃度的硝酸鈉均顯著促進(jìn)了三角褐指藻的生長(zhǎng)，但各組之間的生長(zhǎng)無顯著差異（P>0.05）。氯化銨和尿素濃度從1.0 mmol/L增加至2.1 mmol/L時(shí)，生長(zhǎng)明顯加快，濃度繼續(xù)增加則減緩了藻的生長(zhǎng)。主要是因?yàn)楦邼舛鹊穆然@在培養(yǎng)過程中會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液pH較大的改變，從而抑制微藻的生長(zhǎng)。

2.2 氮源對(duì)三角褐指藻總脂含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不添加氮源時(shí)三角褐指藻脂質(zhì)含量顯著高于添加氮源的試驗(yàn)組，為24.51%（圖2）。以硝酸鈉為氮源，三角褐指藻總脂含量較低，且各組間無顯著差異（P>0.05）；以氯化銨為氮源，隨著濃度的增加，脂質(zhì)含量增加，在氯化銨為8.0 mmol/L時(shí)達(dá)到24.93%；尿素濃度為3.9 mmol/L時(shí)，脂質(zhì)含量達(dá)到18.87%。Shifrin等[7]報(bào)道了30種不同的綠藻和硅藻在氮缺乏條件下都能夠積累脂質(zhì)，本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，王順昌等[8]研究表明在以不同氮源作為培養(yǎng)基時(shí)，導(dǎo)致藻類中性脂肪變化的主要因素是培養(yǎng)液pH的改變，而非氮源本身的作用，以尿素和氯化銨作為氮源脂質(zhì)積累較大的差異可能是由于培養(yǎng)過程pH的變化引起的。

2.3 氮源對(duì)三角褐指藻脂肪酸組成的影響

三角褐指藻脂肪酸組成的變化見表1至表3。大量研究表明，幾乎所有硅藻都含有較多的C14∶0、C16∶0、C16∶1（n-7）和C20∶5（n-3）（EPA）脂肪酸，C18和C22不飽和脂肪酸的含量則較低[9]。該株三角褐指藻的脂肪酸組成與已報(bào)道的結(jié)果比較，C18占總脂肪酸的比例較高，添加氮源后C18脂肪酸占總脂肪酸的比例達(dá)到7.25%～13.64%。C16∶1占總脂肪酸的比例最高，但受氮源種類和濃度影響較小。添加氮源后，C18∶3n6占總脂肪酸的比例明顯下降，飽和脂肪酸（SFAs）占總脂肪酸的比例與對(duì)照相比顯著降低（P<0.05），單不飽和脂肪酸（MPUAs）占總脂肪酸的比例變化較小，而EPA和多不飽和脂肪酸（PUFAs）占總脂肪酸的比例明顯增加。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻，未添加氮源對(duì)照組的EPA占總脂肪酸比例達(dá)到12.2%，顯著高于本次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，可能是因?yàn)榛A(chǔ)培養(yǎng)基中土壤提取液的添加使得對(duì)照組中的氮限制并不明顯[10]。以氯化銨為氮源時(shí)，EPA和PUFAs占總脂肪酸的比例在3.9 mmol/L時(shí)達(dá)到最高，分別為20.40%和26.69%。

三角褐指藻中的單不飽和脂肪酸（MPUAs）占總脂肪酸的45%～50%，可以為生物柴油提供較好的流動(dòng)性。添加氮源培養(yǎng)后，EPA和PUFAs占總脂肪酸的比例明顯提高，分別達(dá)到10%和20%以上，PUFAs，尤其是EPA會(huì)影響生物柴油的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性從而減弱其適用性，但藻油中多于4個(gè)雙鍵的脂肪酸很容易催化氫化[2]。

3 結(jié)論

綜上所述，在大量快速培養(yǎng)三角褐指藻作為生物柴油原料時(shí)，可以選擇合適的氮源如氯化銨，在獲得較高生物量的同時(shí)促進(jìn)藻細(xì)胞積累較多的油脂；脂肪酸組成分析表明三角褐指藻中的EPA和PUFAs的含量較高，會(huì)影響生物柴油的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，但由于不飽和脂肪酸的催化氫化很容易實(shí)現(xiàn)，也不會(huì)成為其作為生物柴油油源的障礙。

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（責(zé)任編輯 張 毅）