摘要：為降低懷地黃（Rehmannia glutinosa f. hueichingensis）試管苗的生產(chǎn)成本，比較了封口膜與蘑菇袋、蔗糖培養(yǎng)與無糖培養(yǎng)、添加谷氨酸（Glu）培養(yǎng)與無Glu培養(yǎng)對(duì)懷地黃試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果表明，蔗糖對(duì)試管苗的生長(zhǎng)發(fā)育有極顯著影響，蔗糖培養(yǎng)明顯優(yōu)于無糖培養(yǎng)；而封口材料與Glu僅對(duì)個(gè)別指標(biāo)有顯著影響，對(duì)懷地黃試管苗的整體生長(zhǎng)發(fā)育情況無顯著影響。所以，可以用蘑菇袋代替封口膜作為封口材料，但不能通過添加Glu用無糖培養(yǎng)代替有糖培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：懷地黃（Rehmannia glutinosa f. hueichingensis）；試管苗；封口材料；蔗糖；谷氨酸；生長(zhǎng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：S567.23+4；S723.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）21-4905-03

Effects of Closures，Sucrose and Glu on the Growth and Development of

Rehmannia glutinosa f. hueichingensis Plantlets

DU Lin，REN Guo-yan，LI Xin，F(xiàn)AN Jin-ling

（Food and Bioengineering College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023，Henan，China）

Abstract： In order to decrease the production costs of Rehmannia glutinosa f. hueichingensis plantlets， the effects of seal film and mushroom bag， sucrose and sucrose-free culture， Glu and Glu-free culture on the growth and development of plantlets were compared. The result showed that sucrose had significant effect on growth and development of plantlets as sucrose culture surpassed sucrose-free culture obviously. Meanwhile， closure and Glu had no remarkable effect on the growth and development of plantlets except for few indexes. It was feasible replacing seal film with mushroom bag， while surose culture could not be replaced by Glu culture.

Key words： Rehmannia glutinosa f. hueichingensis； plantlets； closures； sucrose； Glu； growth and development

懷地黃[Rehmannia glutinosa f. hueichingensis （Chan et Sehih） Hsiao]為玄參科藥用草本植物，是中國(guó)著名的“四大懷藥”之一。但因在生產(chǎn)中長(zhǎng)期采用營(yíng)養(yǎng)繁殖，易受多種病害尤其是病毒病的侵襲，導(dǎo)致其品種退化，品質(zhì)下降[1]。對(duì)于地黃病毒病的防治至今還沒有特效藥物，通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得脫毒苗是目前解決地黃病毒病的最佳途徑[2]，但通過組培快繁脫毒苗存在易污染且生產(chǎn)成本較高等問題[3]，如何降低生產(chǎn)成本就成為懷地黃脫毒苗規(guī)?；a(chǎn)中一個(gè)亟待解決的重要問題。為此，本研究探討了封口材料、蔗糖和Glu對(duì)懷地黃試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

懷地黃“85-5”試管苗來源于焦作市溫縣農(nóng)科所，河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)無菌處理后繼代培養(yǎng)。

1.2 方法

采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)考察懷地黃試管苗在快繁過程中封口材料、蔗糖和谷氨酸3個(gè)因素對(duì)其生長(zhǎng)的影響，因素與水平組合見表1。

快速繁殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L，冷凝脂濃度為0.6%，按表1的處理加入蔗糖及Glu，調(diào)pH為6.0，并在121 ℃、1.1 kg/cm2的壓力下滅菌。將無菌苗切成長(zhǎng)2.5～3.0 cm的帶芽莖段，稱量鮮重后分別接種在培養(yǎng)基上；每組接種3瓶，每瓶接種6株。在溫度（25±2） ℃、光照度2 000 lx、光照時(shí)間14 h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察記錄并于28 d時(shí)稱其鮮重，然后于106 ℃、5 h烘干，稱干重。

1.3 葉綠素含量的測(cè)定

采用丙酮—無水乙醇浸提法[4]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷地黃試管苗的形態(tài)發(fā)育情況

完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)中各處理試管苗的形態(tài)發(fā)育情況見表2。由表2可知，有糖培養(yǎng)的1、2、5、6組生長(zhǎng)情況要明顯優(yōu)于無糖培養(yǎng)的處理組，前者的腋芽萌發(fā)時(shí)間較早，芽生長(zhǎng)較快，萌發(fā)率高，葉色濃綠，而后者腋芽萌發(fā)時(shí)間晚，芽生長(zhǎng)緩慢，葉片發(fā)黃，萌發(fā)率低；且有糖培養(yǎng)可有效地促進(jìn)試管苗根的生長(zhǎng)，而無糖培養(yǎng)中根的生長(zhǎng)情況較差。此外，使用透氣性較好的封口膜的處理組在葉片數(shù)、腋芽萌發(fā)率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)4項(xiàng)指標(biāo)上略好于透氣性較差的蘑菇袋處理組；而Glu對(duì)各處理組形態(tài)發(fā)育的影響不明顯。

2.2 懷地黃試管苗的葉綠素含量

初始培養(yǎng)時(shí)及培養(yǎng)28 d后懷地黃試管苗的葉綠素含量測(cè)定結(jié)果見圖1。由圖1可知，添加蔗糖的處理組其葉綠素含量均高于初始培養(yǎng)時(shí)的，未添加蔗糖的處理組培養(yǎng)28 d后葉綠素含量均低于初始培養(yǎng)時(shí)，說明無糖培養(yǎng)不利于其葉綠素含量的增加；而添加Glu的處理葉綠素含量均明顯高于未添加Glu的，說明Glu有利于葉綠素的合成。

2.3 懷地黃試管苗鮮重和干重

由表3可知，添加蔗糖的試管苗的干重和鮮重增加值均明顯高于未添加蔗糖的；而未添加蔗糖的試管苗其鮮重基本不增加。添加了Glu的處理組鮮重增量和干重也均高于無Glu的處理組，說明Glu對(duì)于試管苗的質(zhì)量增加較為有利。而封口材料對(duì)試管苗質(zhì)量的影響沒有一定的規(guī)律。其中蘑菇袋、添加蔗糖和Glu的處理其鮮重增加值和干重均明顯高于其他處理。

2.4 方差分析結(jié)果

對(duì)各因素對(duì)懷地黃各項(xiàng)指標(biāo)的影響進(jìn)行方差分析，F(xiàn)值見表4。由表4可知，蔗糖對(duì)各指標(biāo)的影響均為顯著或極顯著；Glu僅對(duì)葉綠素含量的影響達(dá)到了極顯著水平，其他均無顯著影響；封口材料對(duì)試管苗的根數(shù)、根長(zhǎng)及葉綠素含量的影響達(dá)到顯著或極顯著水平，而對(duì)其他指標(biāo)無顯著影響，但這3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)試管苗的快速繁殖階段影響不大。因此，封口材料的差異以及Glu添加與否對(duì)懷地黃試管苗的生長(zhǎng)影響不大；而蔗糖對(duì)試管苗的生長(zhǎng)起到了至關(guān)重要的作用。

3 討論與小結(jié)

3.1 封口材料

封口膜是組織培養(yǎng)中常用的封口材料，由于其中心有可透氣的微孔濾膜，可以保證在無菌的情況下進(jìn)行氣體交換，封口膜的價(jià)格是0.1元/張；蘑菇袋又叫食用菌栽培袋，一般由聚乙烯或聚丙烯制作而成，密封性較好而透氣性較差，但價(jià)格非常便宜，約0.002 2元/張。封口膜對(duì)懷地黃試管苗根部的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，這可能是由于良好的透氣性有利于試管苗根的形成與生長(zhǎng)。這與廖飛雄等[5]的研究結(jié)果一致。但是封口材料對(duì)試管苗的冠部生長(zhǎng)并沒有顯著性影響，因此，在懷地黃試管苗的快繁階段可以考慮用蘑菇袋代替封口膜。

3.2 蔗糖

在一些植物的組織培養(yǎng)尤其是生根培養(yǎng)中，可以用無糖培養(yǎng)代替有糖培養(yǎng)[6-8]，但無糖培養(yǎng)過程中不同的植物種類甚至同類植物不同品種之間也存在較大差異[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，懷地黃試管苗在無糖培養(yǎng)情況下生長(zhǎng)幾乎停滯甚至死亡，因此，在懷地黃試管苗的組培快繁中不能簡(jiǎn)單地用無糖培養(yǎng)代替有糖培養(yǎng)。

3.3 Glu

Glu是葉綠素合成的前體物質(zhì)，可以促進(jìn)葉綠素的合成，使葉綠素含量增加，從而使試管苗在進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)的同時(shí)也能進(jìn)行一定的光合自養(yǎng)，有利于干物質(zhì)的增加。閻青云[10]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Glu能夠增加荔枝的葉綠素含量、干物質(zhì)及光合速率。本研究發(fā)現(xiàn)，適量Glu（5 mg/L）的添加有利于葉綠素含量的增加，干物質(zhì)的積累也有所增加，但是未達(dá)到顯著水平。因此，依靠添加Glu用無糖培養(yǎng)替代有糖培養(yǎng)未能實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，在懷地黃試管苗工廠化生產(chǎn)過程中，不能通過添加Glu用無糖培養(yǎng)代替有糖培養(yǎng)，但可以用蘑菇袋代替封口膜，從而節(jié)約生產(chǎn)成本。

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收稿日期：2012-04-06

作者簡(jiǎn)介：杜 琳（1980-），女，河南洛陽人，講師，碩士，主要從事植物生物技術(shù)研究工作，（電話）13598176716（電子信箱）dulin1980@sohu.com。