摘要：采用不同的轉化液制備大腸桿菌（Escherichia coli）JM109感受態(tài)細胞，并進行pUC18質粒的轉化，考察細菌生長狀態(tài)、轉化液、轉化的熱激時間和轉化后所用培養(yǎng)基對轉化率的影響。結果表明，菌液A600 nm為0.705時采用TB轉化液制備感受態(tài)細胞，在42 ℃熱激45 s，轉化后采用SOC培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，轉化效率最高，可達8.59×108 CFU/μg質粒。

關鍵詞：JM109；感受態(tài)細胞；轉化效率

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4902-03

Preparation and Transformation Conditions for Efficient JM109 Competent Cells

XU Tong，LIU Qin-song，ZHANG Cong-cong，LIU Meng-gang

（Shandong Boaoke Biotech Co.， Ltd.， Liaocheng 252000， Shandong， China）

Abstract： Competent cells of Escherichia coli JM109 were prepared by different transformation liquid， and pUC18 was transformed into the competent cells. The effects of different growth state of bacteria， transformation liquid， heat shock time and culture medium after heat shock on transformation efficiency were studied. The results showed that the highest transformation rate could be obtained by preparing the competent cells by TB transformation liquid when bacteria A600 nm was 0.705， heat shocked at 42 ℃ for 45 s and then culturing in SOC medium. The transformation efficiency could reach to 8.59×108 CFU/μg plasmid.

Key words： JM109； competent cell； transformation efficiency

在自然條件下很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，而人工構建的質粒載體一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移；如需將質粒載體轉移進受體細胞，需誘導受體細胞產生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。將大腸桿菌受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法、化學試劑法等）處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞（Competent cell）[1]。不同的大腸桿菌菌株制備感受態(tài)時所要求的菌體密度不同[2]，本研究利用不同的轉化液將大腸桿菌（Escherichia coli）JM109菌株制備成感受態(tài)細胞，進行pUC18質粒的轉化，考察熱激時間和培養(yǎng)基對轉化率的影響，優(yōu)化轉化條件，旨在為感受態(tài)的制備提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質粒 Escherichia coli JM109菌株由山東博奧克生物科技有限公司研發(fā)中心提供；pUC18質粒為該研發(fā)中心實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 KCl、NaCl、CaCl2、Pipes、MnCl2、MgCl2等試劑均為分析純，購自Sigma公司；酵母粉、胰蛋白胨購自美國Oxoid公司。

主要儀器有高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、數顯恒溫水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌器（上海新諾儀器設備有限公司）、紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、超凈工作臺（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）、電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團）等。1.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制 ①LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加入950 mL去離子水，用5 mol/L NaOH調pH至7.0，定容至1 L，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min。②SOB培養(yǎng)基。胰蛋白胨20 g、酵母提取物5 g、氯化鈉0.5 g、1 mol/L氯化鉀2.5 mL，加入去離子水充分溶解后定容至1 L。分成100 mL的小份，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻至室溫后再在每小份中加1 mL滅過菌的1 mol/L氯化鎂（用0.22 μm的濾膜過濾除菌）。③SOC培養(yǎng)基。每100 mL SOB培養(yǎng)基中加2 mL滅菌的1 mol/L葡萄糖。④TB轉化液。0.760 g Pipes、0.816 g CaCl2、1.660 g KCl加入去離子水230 mL，用KOH調pH至7.0后過濾除菌，4 ℃保存。⑤100 mg/mL氨芐青霉素。稱取1 g氨芐青霉素，加入去離子水溶解后定容至10 mL，過濾除菌，-20 ℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌生長狀態(tài)及轉化液對感受態(tài)細胞轉化率的影響 取-70 ℃保存的JM109菌種劃線于無氨芐青霉素的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑單菌落37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。第2天按1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至A600 nm分別為0.30±0.02、0.40±0.02、0.50±0.02、0.60±0.02、0.70±0.02、0.80±0.02、0.90±0.02、1.00±0.02時各取50 mL菌液，4 ℃、4 500 r/min離心10 min，每個處理兩管，1號管加入10 mL 0.1 mol/L預冷的CaCl2溶液，2號管加入10 mL TB轉化液，重懸細胞，冰浴30 min，4 ℃、4 500 r/min離心5 min收集細胞，輕輕懸浮細胞（1號管加入1 mL 0.1 mol/L預冷的含15%甘油的CaCl2溶液，2號管加入含10% DMSO的TB轉化液），冰上放置幾分鐘即成感受態(tài)細胞懸液，分裝后-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?.01 ng的pUC18質粒轉化100 μL感受態(tài)細胞，冰上放置30 min，42 ℃熱激30～90 s，再在冰上放置2 min，加入400 μL無氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取適當菌液涂至含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，2 d后觀察菌落的數量。

轉化率（CFU/μg）=■

1.2.2 熱激時間對感受態(tài)細胞轉化率的影響 按“1.2.1”確定的優(yōu)化方案制備JM109感受態(tài)細胞，加入0.01 ng pUC18質粒，冰浴30 min，42 ℃分別熱激15、25、35、45、55、65、75、85 s后置于冰上2 min，加入400 μL無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，涂適量菌液至含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，計數并計算轉化率。

1.2.3 轉化后所用的培養(yǎng)基對感受態(tài)細胞轉化率的影響 按“1.2.2”優(yōu)化的條件轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，分別加入400 μL無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，涂適量菌液至相應含有氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，計數并計算轉化率。

2 結果與分析

2.1 細菌生長狀態(tài)及轉化液對感受態(tài)細胞轉化率的影響

搖菌過程分別在JM109菌液的A600 nm為0.302、0.417、0.486、0.611、0.705、0.794、0.913、1.016時取樣，用CaCl2和TB轉化液兩種方法制備感受態(tài)細胞，質粒pUC18的轉化率結果見表1。由表1可知，相同的菌液濃度條件下，以TB轉化液制備的JM109感受態(tài)細胞轉化率遠遠高于以CaCl2溶液制備的感受態(tài)細胞，且轉化率隨菌液A600 nm的升高均呈先升高后下降的變化趨勢。菌液A600 nm為0.705時采用TB轉化液制成的感受態(tài)細胞轉化率最高，極顯著高于其他處理（P<0.01）。菌液濃度過低，大腸桿菌細胞總量很少，制成感受態(tài)細胞時接受外源DNA的能力有限，因而轉化率較低；但菌液濃度過高，大腸桿菌處于生長平臺后期，細胞活力下降，也會導致轉化率較低。

低溫（0 ℃）CaCl2溶液中，Ca2+會使細胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物[3]。此時將該體系轉移到42 ℃下作短暫的熱激，細胞膜的液晶結構會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現許多間隙，外源DNA就可能被細胞吸收[3]。Ca2+處理的感受態(tài)細胞轉化率一般能達到5×106～2×107 CFU/μg質粒DNA，可以滿足一般的基因克隆實驗。如在Ca2+的基礎上聯合其他的金屬離子（如K+、Mn2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，則可使轉化率提高100～1 000倍[4-8]，因此其他條件相同時TB轉化液制得的感受態(tài)細胞轉化率比CaCl2溶液制得的高許多。

2.2 熱激時間對感受態(tài)細胞轉化率的影響

培養(yǎng)JM109菌液至A600 nm約為0.7，采用TB轉化液制備感受態(tài)細胞，在42 ℃分別熱激15、25、35、45、55、65、75、85 s，轉化率如圖1所示。由圖1可知，轉化率先隨著熱激時間的延長而迅速升高，到45 s時轉化率最高，為2.64×108 CFU/μg，之后再延長熱激時間，轉化率有所降低。熱激時間過短，細胞膜上出現的間隙少，不利于外源DNA進入，但熱激時間過長會導致細胞死亡。

2.3 轉化后所用培養(yǎng)基對感受態(tài)細胞轉化率的影響

按優(yōu)化的條件制備感受態(tài)細胞并進行質粒轉化，分別在無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基和SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，涂適量菌液至相應含有氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。菌落計數和計算結果表明，LB培養(yǎng)基中感受態(tài)細胞轉化率為4.27×108 CFU/μg，SOC培養(yǎng)基中感受態(tài)細胞轉化率為8.59×108 CFU/μg，二者之間的差異達極顯著水平。這可能是因為SOC培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基具有更豐富的營養(yǎng)，質粒轉進菌體內后菌體復蘇快，利于菌體生長增殖，轉化率較高。

3 小結與討論

大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化效率受很多因素的影響，其中之一就是細菌細胞必須處于對數生長早期，由生長過度或發(fā)育不全的細菌制備的感受態(tài)細胞轉化效率較低。另外一個重要的因素是Ca2+，Ca2+能與細胞膜形成復合物PHP/Ca以利于外源DNA的滲入，本實驗結果表明用K+、Pipes與Ca2+按一定比例搭配使用制作感受態(tài)細胞時，其轉化效率優(yōu)于單純使用Ca2+[1，2]。

大腸桿菌加熱至42 ℃時短暫熱刺激處理細菌細胞，細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，形成間歇利于質粒DNA分子進入細胞，本實驗顯示熱激45 s時，JM109感受態(tài)的轉化效率最高。另外細菌的培養(yǎng)基也影響感受態(tài)的轉化效率。SOC培養(yǎng)基中富含多種營養(yǎng)物質，當外源DNA導入感受態(tài)時能提供給菌體大量營養(yǎng)，使細菌快速生長繁殖[6]。

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收稿日期：2012-02-23

作者簡介：許 彤（1984-），女，山東聊城人，主要從事重組蛋白及單克隆抗體方面的工作，（電話）15506445078（電子信箱）xutong889@163.com；

通訊作者，劉欽松，男，山東聊城人，高級工程師，（電子信箱）boaoke163@163.com。