摘要：從吉林白鵝（Anser cygnoides）肝臟組織提取基因組DNA，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計一對加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的特異性引物，PCR擴增得到α干擾素基因（IFN-α），將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落進行鑒定和測序。結(jié)果表明，IFN-α已被成功克隆。序列分析結(jié)果顯示該基因序列與GenBank中已知的獅頭鵝（A. anser）IFN-α序列（登錄號HQ009755）同源性為99.5%。

關(guān)鍵詞：吉林白鵝（Anser cygnoides）；α干擾素基因；克隆；序列分析

中圖分類號：Q785；S835 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4899-03

Cloning and Sequence Analysis of Interferon-α Gene in Jilin White Goose

LI Gong-mei1，LI Mao-hui2，YAN Jin-ming2，LI Yu-mei3，LIU Ke-yue4，QIAN Ai-dong1

（1.College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

2.Jilin China Tai Enterprise Co.， Ltd.， Changchun 130033， China；3. Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Jilin University， Changchun 130062，China； 4. School of Basic Medical Science， Jiujiang University， Jiujiang 332000， Jiangxi， China）

Abstract： The interferon-α gene（IFN-α）fragment was amplified with a pair of specific primers within BamHⅠ and EcoRⅠ restriction sites by PCR with the genome DNA extracted from liver of Jilin white goose（Anser cygnoides）. PCR product was cloned into vector pMD18-T and used to transform DH5α competent cell. Sequential analysis showed that the IFN-α was successfully cloned. Its homogeneity with reported A. anser IFN-α gene in GenBank（Accession No. HQ009755） was 99.5%.

Key words： Jilin white goose（Anser cygnoides）； IFN-α gene； cloning； sequence analysis

干擾素（Interferon，IFN）是一種干擾病毒繁殖的免疫活性細(xì)胞因子[1]，其中α干擾素（IFN-α）可抑制感染細(xì)胞中病毒mRNA的翻譯，并促使病毒mRNA降解，能提高細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達水平，有助于向T細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解，并可增強NK細(xì)胞對病毒的殺傷能力[2]。目前人[3]、狗[4]、豬[5]、雞[6，7]、鴨[8]等的IFN序列均已被克隆，并進行了相應(yīng)的研究及臨床應(yīng)用，關(guān)于鵝（Anser cygnoides）IFN的報道較少，本研究參照獅頭鵝（A. anser）[9]等IFN的報道，利用動物基因組試劑盒提取鵝肝臟中的總DNA，采用PCR技術(shù)克隆獲得吉林白鵝IFN-α基因，并對其進行序列測定分析，以期為進一步研究鵝IFN的分子生物學(xué)特性、抗病毒作用機理及研制防治鵝病毒性疾病的新型制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室飼養(yǎng)的2月齡吉林白鵝。

E. coli DH5α由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)實驗室提供；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、SacⅠ、 XhoⅠ、瓊脂糖、dNTPs、X-Gal、T4 DNA Ligase購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；氨芐青霉素、DNA凝膠回收純化試劑盒購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 吉林白鵝基因組DNA提取 吉林白鵝頸靜脈放血致死，無菌取1～20 mg肝臟，采用DNA提取試劑盒提取吉林白鵝肝臟中的基因組。

1.2.2 IFN-α序列的PCR擴增 根據(jù)GenBank中獅頭鵝的IFN-α序列（GenBank登錄號：HQ 009755）設(shè)計引物，上、下游引物序列分別為P1：5′-ATAGGATCCAACATGCCTGGGCCATCAG-3′；P2：5′-TCCGAATTCTTAGCGCATGGTGCGG-3′（劃線部分分別為BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點），目標(biāo)片段大小為576 bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。以鵝肝臟總DNA為模板對IFN-α基因進行PCR擴增。50 μL PCR反應(yīng)體系包括ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、20 μmol/L P1、P2各1 μL、DNA模板 4 μL、5 U/μL Ex Taq 0.5 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 8 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 mim，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 IFN-α基因的克隆與序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，與pMD18-T載體連接，得到pMD18-T-IFN-α，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板，挑取單菌落接種到LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒并進行酶切鑒定。將陽性重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。測序結(jié)果與GenBank中獅頭鵝的IFN-α基因進行核苷酸序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFN-α基因的PCR擴增結(jié)果

以從吉林白鵝肝臟組織提取的基因組DNA為模板擴增IFN-α基因，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后得到一條特異性條帶，條帶清晰明亮，大小約為600 bp，與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 IFN-α基因的克隆與鑒定

將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，得到pMD18-T-IFN-α，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落，用BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定，同時進行質(zhì)粒的PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致（圖2），說明IFN-α基因已被成功克隆。

2.3 IFN-α基因測序結(jié)果

測序結(jié)果顯示本實驗擴增出了全長為576 bp的基因片段，編碼191個氨基酸，氨基酸的N端為由30個疏水氨基酸組成的信號肽，其余為由161個氨基酸組成的成熟多肽，其中成熟多肽中有2個糖基化結(jié)合位點和7個半胱氨酸殘基。經(jīng)DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn)所測序列與GenBank中的獅頭鵝HQ 009755核苷酸序列相似性高達99.5%（圖3），僅在397位有1個堿基發(fā)生突變，即由C變?yōu)镚，說明吉林白鵝IFN-α基因序列存在單核苷酸多態(tài)性。推導(dǎo)的IFN-α氨基酸序列見圖4，其與GenBank中獅頭鵝IFN-α氨基酸序列同源性為99%。進一步將吉林白鵝IFN-α與GenBank中鴨、雞及人的IFN-α基因序列和氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)吉林白鵝IFN-α與鴨、雞及人相應(yīng)核苷酸序列的同源性分別為97.2%、44.3%及25.5%，而氨基酸序列的同源性分別為94.5%、17.3%及5.8%。

3 討論

干擾素有種屬特異性，親緣關(guān)系越近其同源性越高，本實驗吉林白鵝IFN-α基因與GenBank中已知獅頭鵝的IFN-α基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為99.5%和99%，而與雞及人的IFN-α基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均低于50%。雖然克隆得到的鵝IFN-α基因與雞及哺乳動物相關(guān)基因的同源性較低，但其半胱氨酸具有保守性，且同樣存在著2個糖基化位點，表明它也是一種糖蛋白。

干擾素作為一種抑制和干擾病毒繁殖的可溶性細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等方面發(fā)揮著重要的作用[10]，可刺激機體淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白質(zhì)，阻斷病毒的繁殖。當(dāng)干擾素系統(tǒng)被激活后，細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘就產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)，動物在1～3周內(nèi)對其他病毒的重復(fù)感染也有抵抗作用[11]。雖然病毒性疾病能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生少量干擾素，在體內(nèi)抑制病毒的增殖，但因表達量低難以保護機體抵抗疾病的侵襲，因此研究人員希望能通過基因工程方法規(guī)?；@得鵝重組干擾素并將其應(yīng)用到臨床。本實驗為進一步研究鵝IFN-α在抗病毒、抗腫瘤等方面的作用及鵝IFN生物制劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] JANEWAY C A，TRAVERS P，WALPORT M， et al. Immunobiology： The immune system in health and disease[M]. 6th ed. New York： Garland Science，2004.

[2] 焦茂興，王聲會，黃毓茂. 豬α-干擾素基因的分子克隆和序列分析[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技，2007，32（2）：47-49.

[3] GRAY P W，LEUNG D W，PENNICA D，et al. Expression of human immune interferon CDNA in E. coli and monkey cells[J]. Nature，1982，295：503-508.

[4] HIMMLER A， HAUPTMANN R， ADOLF G R， et al. Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon-α genes[J]. Journal of Interferon Research，1987，7（2）：173-183.

[5] ARTURSSON K， GOBL A， LINDERSSON M， et al. Molecular cloning of a gene encoding porcine interferon-β[J]. Journal of Interferon Research，1992，12（3）：153-160.

[6] DIGBY M R，LOWENTHAL J W. Cloning and expression of the chicken interferon-γ gene[J]. Journal of Interferon Cytokine Research，1995，15（11）：939-945.

[7] 夏 春，汪 明.惠陽胡須雞干擾素基因分子克隆與序列分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2000，31（6）：563-566.

[8] SCHULTZ U，CHISARI F V. Recombinant duck interferon gamma inhibits duck hepatitis B virus replication in primary hepatocytes[J]. Journal of Virology，1999，73（4）：3162-3168.

[9] 鄭曉靈，盧 曦，劉艷芬，等.獅頭鵝α-干擾素基因的克隆與遺傳分析[J].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，35（6）：29-33.

[10] 李 巖，邵念鵬.γ干擾素的研究與臨床應(yīng)用[J].河北省科學(xué)院學(xué)報，2001，18（3）：174-178.

[11] 侯云德.分子病毒學(xué)[M].北京：學(xué)苑出版社，1990.598-642.

收稿日期：2011-11-16

作者簡介：李公美（1975-），女，山東費縣人，講師，在讀博士研究生，主要從事動物病毒學(xué)研究，（電話）13894890311（電子信箱）

Lzx2006327@163.com；通訊作者，錢愛東，教授，博士生導(dǎo)師，（電話）0431-84533426（電子信箱）qianaidong0115@163.com。