摘要：采用PCR擴(kuò)增釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ號染色體ARS304序列（S1）及以ARS304為核心上下游延伸1 kb的側(cè)翼序列（S2），并將目的片段分別構(gòu)建到酵母整合載體pRS405中，獲得重組質(zhì)粒pRS1和pRS2。質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pRS2的轉(zhuǎn)化率大于pRS1，說明ARS304側(cè)翼序列能顯著提高ARS304在釀酒酵母中自主復(fù)制的能力。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；自主復(fù)制序列（ARS）；重組質(zhì)粒；復(fù)制起始活性

中圖分類號：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4891-03

Construction and Identification of Recombinant Plasmids of Saccharomyces cerevisiae ARS304 and Its Flank Sequence

LI Jun，WANG Xin，ZHANG Qi-sheng，CAI Lu

（Institute of Bioengineering and Technology，Inner Monglia University of Science and Technology， Baotou 014010， Inner Monglia，China）

Abstract： ARS304 gene（S1） and its flank sequence（S2） of Saccharomyces cerevisiae were cloned by PCR， and then connected into the shuttle vector pRS405. Recombinant plasmids pRS1 and pRS2 were successfully constructed and used for electroporation of S. cerevisiae. Results showed that the electricity transformation rate of pRS2 was higher than that of pRS1， indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304 in S. cerevisiae.

Key words： Saccharomyces cerevisiae； autonomously replicating sequence（ARS）； recombinant plasmids； replication origins activity

復(fù)制起始的調(diào)控涉及細(xì)胞周期的調(diào)控、基因擴(kuò)增、腫瘤發(fā)生等重大生物學(xué)問題，是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要內(nèi)容。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中復(fù)制起始依賴的順式作用元件被稱為自主復(fù)制序列（Autonomously replicating sequence， ARS），典型的ARS有一段11 bp富含A/T的保守序列[5’-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3’]，稱為ACS（ARS consensus sequence），這些位點(diǎn)發(fā)生突變時會導(dǎo)致ARS失去活性，進(jìn)而影響到復(fù)制起始的功能。在釀酒酵母Ⅲ號染色體上已發(fā)現(xiàn)有19個ARS元件，但卻存在超過3 800個與ACS相似的序列，并且其中60%的序列能與ACS的8～10個位點(diǎn)匹配[1]，說明自主復(fù)制并不單純受ACS元件數(shù)目、方向以及解旋基序數(shù)目所控制，其活性可能還與其他因素有關(guān)，諸如ARS側(cè)翼序列特征、核小體定位、染色質(zhì)修飾等[2]。對酵母的ARS進(jìn)行研究，了解酵母染色體復(fù)制起始機(jī)制，有利于進(jìn)一步在表觀遺傳學(xué)水平上探究真核生物復(fù)制機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并鑒定釀酒酵母ARS304及其側(cè)翼序列重組質(zhì)粒，以期為以酵母為模式生物研究真核基因復(fù)制機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Esherichia coli DH5α為內(nèi)蒙古科技大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室保藏。釀酒酵母YPH499（MATa ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、穿梭質(zhì)粒pRS405由美國新澤西州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與分子遺傳學(xué)部Carol S. Newlon教授提供。

1.1.2 酶與試劑 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自TaKaRa公司，Agarose購自Invitrogen公司。PCR引物合成及DNA測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L+NaCl 10 g/L+酵母浸提物5 g/L，固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂），培養(yǎng)條件為37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；酵母YPH499的培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基（胰蛋白胨 20 g/L+酵母浸提物10 g/L，高壓滅菌20 min后加入100 mL滅菌的20 g/L葡萄糖溶液，固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂），培養(yǎng)條件為28 ℃暗培養(yǎng)18 h。

1.2 方法

1.2.1 珠磨法提取釀酒酵母基因組DNA 收集培養(yǎng)16～18 h的酵母YPH499菌液，用TE洗滌2次后溶于200 μL TE；加入50 mg玻璃珠（直徑0.3～0.5 mm）和100 μL苯酚—氯仿（體積比25∶24，下同），渦漩振蕩2～3 min，12 000 r/min離心2 min；取上清，加入等體積苯酚—氯仿，振蕩混勻后12 000 r/min離心5 min；取上清，加入0.5 μL Rnase A，37 ℃溫浴30 min；加入2倍體積的無水乙醇，-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心5 min，沉淀物用70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇洗2次，自然干燥后溶于20 μL TE，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA[3]。

1.2.2 ARS304及側(cè)翼序列片段PCR擴(kuò)增及純化 根據(jù)Saccharomyces Genome Database中釀酒酵母Ⅲ號染色體上的ARS304序列設(shè)計兩對引物分別擴(kuò)增釀酒酵母ARS304（S1）及以ARS304為核心上下游延伸1 kb的序列（S2）。引物序列分別為PF1：

5′-CGGGATCCCGGAAGTGCAGAACAAAGAGG-3′

（BamHⅠ），PR1：5′-CGCGAGCTCGGCAGGAGCAG

CACACAGATC-3′（SacⅠ）；PF2：5′-CGGGATCCCGC

TAGTGCTTAAGTTCTGTTG-3′（BamHⅠ），PR2：

5′-CGCGAGCTCGGCAGTCTTTAAACGCGCCTT-3′

（SacⅠ）。

以釀酒酵母YPH499基因組為模板，利用上述引物擴(kuò)增釀酒酵母ARS304及側(cè)翼序列。擴(kuò)增體系為50 μL：ddH2O 37 μL、10×Buffer（Mg2+） 5 μL、dNTPs 4 μL、PF （10 μmol/L） 0.5 μL、PR（10 μmol/L） 0.5 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 4.0 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 35 s（S2：48 ℃ 45 s），72 ℃ 1 min； 72 ℃ 10 min，30個循環(huán)。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并采用純化試劑盒進(jìn)行回收純化。

1.2.3 重組質(zhì)粒pRS1、pRS2的構(gòu)建 對純化后的PCR產(chǎn)物和酵母穿梭載體pRS405進(jìn)行BamHⅠ/SacⅠ雙酶切；連接pRS405酶切大片段和S1（S2）雙酶切產(chǎn)物；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；提取質(zhì)粒，對其分別進(jìn)行PstⅠ/SacⅠ和SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pRS1及pRS2。

1.2.4 酵母電轉(zhuǎn)化 具體方法參考文獻(xiàn)[4]，轉(zhuǎn)化效率=產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)/質(zhì)粒DNA質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母基因組DNA的提取結(jié)果

釀酒酵母細(xì)胞壁厚約25 nm，以葡聚糖為主，有一定韌性。因此提取酵母基因組DNA的關(guān)鍵在于選擇一種合適的方法破壁，使菌體內(nèi)的核酸釋放出來。目前報道的酵母基因組DNA的提取方法主要有堿裂解法、液氮研磨法、超聲波法、復(fù)合酶法、珠磨法等。本實(shí)驗(yàn)采用珠磨法提取酵母基因組，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1，可以看出，提取的酵母基因組DNA條帶清晰明亮，沒有拖帶。珠磨法價格便宜，操作簡單，提取的釀酒酵母基因組滿足后續(xù)擴(kuò)增目的片段的需要。

2.2 S1、S2序列的PCR擴(kuò)增

以釀酒酵母YPH499基因組為模板擴(kuò)增ARS304（S1，486 bp）和以ARS304為核心上下游延伸1 kb的側(cè)翼序列（S2，2 358 bp），采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖2、圖3。從圖中可以看出，目的片段條帶單一清晰、大小與預(yù)期相符。

2.3 重組質(zhì)粒pRS1及pRS2克隆的鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物S1及S2經(jīng)BamHⅠ/SacⅠ雙酶切后分別連接到穿梭載體pRS405上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后分別用Pst Ⅰ/Sac Ⅰ和Sac Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切檢測（圖4、圖5）。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pRS1經(jīng)過Pst Ⅰ/Sac Ⅰ雙酶切后出現(xiàn)大小兩條帶，短片段的大小約為550 bp；重組質(zhì)粒pRS2經(jīng)過Sac Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，大小約為5 500 bp和2 400 bp，均與預(yù)期相符。

2.4 重組質(zhì)粒pRS1及pRS2功能鑒定

酵母轉(zhuǎn)化效率是鑒定自主復(fù)制活性強(qiáng)弱的直接指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以整合型質(zhì)粒pRS405為陽性對照，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRS1及pRS2電轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499，在SD平板上篩選Leu+的轉(zhuǎn)化子，根據(jù)酵母轉(zhuǎn)化效率判斷3種質(zhì)粒的自主復(fù)制活性，結(jié)果見圖6。圖6顯示整合型質(zhì)粒pRS405由于其復(fù)制依賴于整合到酵母的染色體上，轉(zhuǎn)化率低（6轉(zhuǎn)化子/μg DNA），而同等條件下在pRS405多克隆位點(diǎn)插入ARS304，整合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)變成復(fù)制型質(zhì)粒pRS1，轉(zhuǎn)化率是原來的8.8倍（53轉(zhuǎn)化子/μg DNA）；重組質(zhì)粒pRS2由于包含以ARS304為核心上下游延伸1 kb的側(cè)翼序列，轉(zhuǎn)化率有了顯著提高（324轉(zhuǎn)化子/μg DNA），說明ARS304側(cè)翼序列能顯著提高ARS304的自主復(fù)制活性。

3 小結(jié)與討論

在真核細(xì)胞中，DNA復(fù)制是在特定復(fù)制起始點(diǎn)上開始的。酵母中潛在的起始點(diǎn)比在每個細(xì)胞周期中實(shí)際使用的起始點(diǎn)要多。雖然在酵母中大多數(shù)ARS都被復(fù)制起始識別復(fù)合體（Origin recognition complex，ORC）結(jié)合[5]，但其中有些位點(diǎn)的使用頻率比其他位點(diǎn)的更高，且有一些潛在的起始點(diǎn)在正常生長條件下從不使用。但是當(dāng)克隆到質(zhì)粒上時，這些序列也能作為有效的起始點(diǎn)行使功能[6]。因此，在酵母細(xì)胞核中染色體的環(huán)境能決定哪些潛在的位點(diǎn)被用作起始點(diǎn)以及使用的頻率。如酵母Ⅲ號染色體上有19個ARS，但由于側(cè)翼序列的影響，并不是所有的都具有復(fù)制起始活性或活性較低[7]。Srienc等[8]研究發(fā)現(xiàn)敲除Ⅲ號染色體上其他高活性ARS時，ARS304的復(fù)制起始活性會大大增強(qiáng)。Eaton等[2]利用高通量的序列分析測定了酵母體內(nèi)ARS兩側(cè)的核小體定位圖譜，發(fā)現(xiàn)酵母復(fù)制起始位點(diǎn)ARS兩側(cè)的核小體分布具有一定的規(guī)律，且ORC的結(jié)合也需要ARS兩側(cè)精確的核小體定位。

本研究成功構(gòu)建了酵母Ⅲ號染色體HML區(qū)外第一個活性較低的ARS304及以ARS304為核心上下游延伸1 kb的側(cè)翼序列的重組質(zhì)粒pRS1和pRS2。質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARS304側(cè)翼序列能顯著提高ARS304的復(fù)制活性。后續(xù)研究將在pRS1、pRS2重組質(zhì)粒上組裝核小體，研究核小體的分布及定位對復(fù)制起始活性的影響。

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收稿日期：2011-12-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（61072129）；內(nèi)蒙古科技大學(xué)創(chuàng)新基金（2011NCL005）

作者簡介：李 珺（1979-），女，寧夏石嘴山人，講師，碩士，主要從事表觀遺傳學(xué)研究，（電話）15847087336（電子信箱）star1979@126.com；

通訊作者，蔡 祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物信息學(xué)與分子生物學(xué)研究工作。